Explorando la interacción entre el péptido señal de translocación reticular y el translocón Sec61 mediante espectroscopía de fuerza a nivel de molécula individual

Abstract

Sec61 es un canal transportador de proteínas, conocido como translocón, que se encuentra en la membrana del retículo endoplasmático en eucariontes. Su función es permitir el paso de las proteínas desde el citosol al lumen reticular en un proceso conocido como translocación, que es el primer paso de la vía de exportación de proteínas. En humanos, alrededor de un 38% de las proteínas sintetizadas por la célula transloca al lumen reticular. Esto se debe a que poseen una secuencia de aminoácidos, en su extremo N-terminal, conocida como «péptido señal», la cual cumple un rol de reclutamiento de la proteína a la membrana del retículo y, luego, de interacción con el translocón. Esta última función representa el primer paso del proceso de translocación, por lo que es particularmente interesante de estudiar. El péptido señal posee una secuencia poco conservada entre proteínas, sin embargo, se distinguen tres regiones comunes en todos ellos: una región N-terminal de residuos de carga positiva (región n), una región hidrofóbica en forma de hélice α (región h) y una región C-terminal de residuos polares de cadena corta (región c). Se ha descrito que la región h es fundamental para el proceso de translocación, ya que las mutaciones en residuos hidrofóbicos de esta secuencia disminuyen drásticamente las tasas de translocación y secreción. La región h del péptido señal actúa mediante su inserción en una «compuerta lateral» del canal Sec61, causando un cambio conformacional que abre el poro y deja al translocón en una conformación activa. Para estudiar el proceso de translocación, se ha utilizado como modelo la proteína Prepro-alpha-factor (PpαF) de S. cerevisiae, que fue la primera proteína descrita en presentar un mecanismo de translocación postraduccional en eucariontes. Se ha visto que la mutación puntual Ala13Glu, en la región h del péptido señal de PpαF, disminuye hasta 50 veces la tasa de translocación. Una hipótesis que explicaría este fenómeno es que la mutación Ala13Glu disminuye la energía libre del estado de transición del proceso de disociación, mientras que aumenta la constante cinética de disociación, en la interacción entre el péptido señal y el canal Sec61, en comparación a la proteína silvestre. Se estudió esta hipótesis mediante espectroscopía de fuerzas utilizando pinzas ópticas, herramienta que permite medir la interacción entre proteínas a nivel de molécula única (in singulo). Como primer objetivo se preparó a la proteína PpαF y su mutante Ala13Glu para su manipulación con pinzas ópticas. Con este fin, se llevó a cabo mutagénesis de sitio dirigido por PCR para incorporar un residuo de cisteína, necesario para enlazar de manera covalente a las proteínas, en la posición 165 (mutación Tyr165Cys). Luego, se expresaron y purificaron las mutantes Tyr165Cys y Ala13Glu/Tyr165Cys, ambas con un marcador 6xHis-tag en su extremo C-terminal, por cromatografía de afinidad. Un segundo componente vital del experimento son las mangas de ADN, las cuales sirven de espaciador y como estándar de fuerza, debido a su deformación característica a 67 pN. Se sintetizaron las mangas por PCR a partir de un plásmido, utilizando un partidor biotinilado y otro tiolado, para obtener un producto final que forme un enlace disulfuro a PpαF y se una a la microesfera recubierta con estreptavidina gracias a la biotina incorporada. En tercer lugar, se purificó el translocón Sec61 de levadura. Para esto, se separaron fracciones microsomales y se purificó el translocón a partir de ellas utilizando digitonina como detergente. Se preparó al translocón para el experimento incubando con microesferas recubiertas por anticuerpos anti-Sec61. Se realizó el experimento de espectroscopía de fuerzas para obtener las fuerzas de ruptura de la interacción entre las quimeras de PpαF-DNA y el translocón. Se filtraron los histogramas de fuerza de ruptura a partir del histograma del control negativo sin PpαF, correspondiente a las interacciones inespecíficas que no están en estudio. Se ajustaron los datos al modelo de Dudko-Hummer-Szabo para obtener los parámetros de tiempo de vida (τ0), distancia al estado de transición (Δx‡) y energía libre al estado de transición (ΔG‡) del proceso de disociación. Los datos ajustaron mejor a un modelo de decaimiento exponencial (ecuación de Bell), que no permite obtener datos de ΔG‡. Los parámetros obtenidos para PpαF silvestre fueron τ0 = 10 ± 4 s y Δx‡ = 1×10-2 ± 6×10-2 nm, y para la mutante Ala13Glu se obtuvieron τ0 = 7 ± 3 s y Δx‡ = 4×10-3 ± 2×10-3 nm. Δx‡ tiene una diferencia significativa con p < 0,05, no así τ0. Las constantes cinéticas de disociación se calcularon como el inverso multiplicativo de τ0: koff = 1×10-1 ± 4×10-2 s-1 y 1,4×10-1 ± 5×10-2 s-1 respectivamente, sin diferencias significativas. Por otra parte, a las mismas concentraciones de proteína, las esferas con PpαF Ala13Glu interaccionan un porcentaje significativamente menor (31%) con el translocón que aquellas con PpαF con péptido señal silvestre (49%). Estos resultados indicarían que el defecto en translocación de la mutación Ala13Glu puede ser multifactorial. Una menor distancia al estado de transición implica una mayor rigidez de la interacción, mientras que una menor adhesividad de las esferas apunta a un efecto negativo sobre la asociación con el translocón, lo que rechaza la hipótesis

Sec61 is a protein transporter channel, known as the translocon, found in the membrane of the endoplasmic reticulum in eukaryotes. Its function is to allow the passage of proteins from the cytosol to the reticular lumen in a process known as translocation, which is the first step in the protein secretory pathway. In humans, about 38% of the proteins synthesized by the cell translocate to the reticular lumen. This is because they possess an amino acid sequence, at its N-terminus, known as a “signal peptide”, which plays a role of recruiting the protein to the reticulum membrane and, later, of interaction with the translocon. This last function represents the first step in the translocation process, making it particularly interesting to study. The signal peptide has a poorly conserved sequence between proteins, however, three common regions are distinguished in all of them: an N-terminal region of positively charged residues (n region), a hydrophobic region in the form of an α helix (h region) and a C-terminal region of short-chain polar residues (c region). The h region is essential for the translocation process, as mutations in hydrophobic residues in this sequence dramatically decrease translocation and secretion rates. The h region of the signal peptide acts by inserting it into a "lateral gate" of the Sec61 channel, causing a conformational change that opens the pore and leaves the translocon in an active conformation. To study the translocation process, the S. cerevisiae protein Prepro-alpha-factor (PpαF), which was the first protein described to present a post-translational translocation mechanism in eukaryotes, was used as a model. The Ala13Glu point mutation, in the h region of the PpαF signal peptide, has been shown to decrease the translocation rate by up to 50 times. One hypothesis that would explain this phenomenon is that the Ala13Glu mutation decreases the free energy of the transition state of the dissociation process, while increasing the dissociation kinetic constant, in the interaction between the signal peptide and the Sec61 channel, compared to the protein wild type. This hypothesis was studied by force spectroscopy using optical tweezers, a tool that allows the interaction between proteins to be measured at the single molecule level (in singulo). As a first target, the PpαF protein and its Ala13Glu mutant were prepared for manipulation with optical tweezers. To this end, PCR-directed site mutagenesis was carried out to incorporate a cysteine residue, necessary to covalently bind to proteins, at position 165 (Tyr165Cys mutation). The Tyr165Cys and Ala13Glu/Tyr165Cys mutants were then expressed and purified, both with a 6xHis-tag at their C-terminus, by affinity chromatography. A second vital component of the experiment are the DNA handles, which serve as a spacer and as a force standard, due to their characteristic deformation at 67 pN. The handles were synthesized by PCR from a plasmid, using a biotinylated and a thiolated primer, to obtain a final product that forms a disulfide bond to PpαF and binds to the microsphere coated with streptavidin thanks to the incorporated biotin. Third, the yeast Sec61 translocon was purified. For this, microsomal fractions were separated and the translocon was purified from them using digitonin as a detergent. The translocon was prepared for the experiment by incubating with microspheres coated with anti-Sec61 antibodies. The force spectroscopy experiment was performed to obtain the rupture force of the interaction between the PpαF-DNA chimeras and the translocon. The rupture force histograms were filtered from the histogram of the negative control without PpαF, corresponding to the nonspecific interactions that are not under study. The data were fitted to the Dudko-Hummer-Szabo model to obtain the parameters of lifetime (τ0), distance to the transition state (Δx‡) and free energy to the transition state (ΔG‡) of the dissociation process. The curve of best fit was to an exponential decay model (Bell equation), which does not allow to obtain data from ΔG‡. The parameters obtained for wild PpαF were τ0 = 10 ± 4 s and Δx‡ = 1×10-2 ± 6×10-2 nm, and for the Ala13Glu mutant, τ0 = 7 ± 3 s and Δx‡ = 4×10-3 ± 2×10-3 nm were obtained. Δx‡ has a significant difference with p <0.05, but not τ0. The dissociation kinetic constants were calculated as the multiplicative inverse of τ0: koff = 1×10-1 ± 4×10-2 s-1 and 1.4×10-1 ± 5×10-2 s-1 respectively, without significant difference. On the other hand, at the same protein concentrations, spheres with PpαF Ala13Glu interact a significantly lower percentage (31%) with the translocon than those with PpαF with wild-signal peptide (49%). These results would indicate that the translocation defect of the Ala13Glu mutation can be multifactorial. A smaller distance to the transition state implies a greater rigidity of the interaction, while a lower adhesiveness of the spheres points to a negative effect on the association with the translocon. This rejects the original hypothesis