Efecto del péptido angiotensina-(1-9) sobre la desdiferenciación de las células musculares lisas vasculares

Abstract

Durante la progresión y desarrollo de las enfermedades cardiovasculares (ECV), en particular las asociadas con los vasos sanguíneos, las células de la musculatura lisa vascular (VSMC) cambian de fenotipo, pasando de uno diferenciado a uno desdiferenciado. Las VSMC desdiferenciadas se caracterizan por tener aumentada la proliferación, migración y la secreción de matriz extracelular. Este fenotipo es responsable del estrechamiento y fibrosis de la pared arterial, exacerbando la lesión vascular. El inicio y progresión de diversas ECV es gatillada por varios agentes, entre los que se destacan la angiotensina II, el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y TNF-α, que inducen la desdiferenciación de las VSMC. El sistema renina-angiotensina (RAS) es fundamental en la fisiología cardiovascular, controlando la vasoconstricción, la inflamación y el remodelado vascular. Está constituido por angiotensina I (Ang I), la enzima convertidora de angiotensina (ECA), angiotensina II (Ang II) y el receptor de angiotensina II de tipo 1 (AT1R). Una desregulación de este sistema contribuye de forma significativa a la fisiopatología de las ECV, principalmente producto de la acción de Ang II sobre AT1R. También se ha descrito un RAS alterno que tiene como componentes a la ECA homóloga (ECA2), angiotensina-(1-7) [Ang-(1-7)], angiotensina-(1-9) [Ang-(1-9)] y AT2R. Se ha demostrado que este RAS alterno tiene efectos vasodilatadores, antiproliferativos, antiinflamatorios y anti-remodelado. Sin embargo, se sabe poco sobre los efectos directos de la Ang-(1-9) sobre las VSMC. Para dilucidar parte de esta interrogante es que la hipótesis de este trabajo fue “Angiotensina-(1-9) previene la desdiferenciación de las células musculares lisas vasculares inducida por PDGF-BB a través de la vía AT2R/Akt/FoxO1”. Se plantearon los siguientes objetivos específicos: (1) Determinar el efecto de angiotensina-(1-9) en el cambio de fenotipo de las células musculares lisas vasculares inducido por PDGF BB mediante el receptor AT2. (2) Evaluar el efecto de angiotensina-(1-9) sobre FoxO1 a través de la inhibición de Akt en células musculares lisas vasculares. (3) Determinar la participación de FoxO1 en el efecto de angiotensina-(1-9) sobre la desdiferenciación de las células musculares lisas vasculares inducido por PDGF-BB. Para llevar a cabo este trabajo se utilizó la línea celular de VSMC A7r5 y cultivos primarios de VSMC de aorta de rata. Inicialmente se realizó una curva dosis respuesta, determinando que Ang-(1-9) 1 μM era la dosis más baja en presentar efectos antagónicos a PDGF-BB. Ang-(1-9) por sí sola, no modificó la proliferación ni la migración basal y tampoco alteró la cantidad de proteínas contráctiles. Sin embargo, Ang-(1-9) previno la proliferación inducida por PDGF-BB medida por ciclo celular, expresión de Ki67 nuclear y de ciclina total. Además, PDGF-BB indujo migración en las células medida por ensayo de herida y transwell la cual fue prevenida cuando se incubó previamente con Ang-(1-9). Por último, PDGF-BB disminuyó las proteínas contráctiles (α-SMA, SM22 y calponina) en VSMC. Este efecto se previno al preincubar con Ang-(1-9). Todos estos efectos de Ang-(1-9) se bloquearon cuando se utilizó un antagonista de AT2R como PD123319. Por otra parte, Ang-(1-9) redujo la fosforilación de Akt y FoxO1 a los 30 min, seguido de un aumento del contenido total de proteína FoxO1 a las 3 horas. Todos estos efectos se bloquearon por PD123319 y por la sobreexpresión de Akt-Myr (forma de Akt constitutivamente activa). Finalmente, se demostró la participación de FoxO1 en los efectos de Ang-(1-9) utilizando un siRNA contra FoxO1 o un inhibidor de FoxO1, AS1842856. Por otra parte, la sobreexpresión adenoviral de FoxO1 imitó los efectos de Ang-(1-9) frente a PDGF-BB. Estos datos sugieren que Ang-(1-9) previene la desdiferenciación de las VSMC inducida por PDGF-BB mediante un mecanismo dependiente de AT2R/Akt/FoxO1. Estos resultados apoyan la posibilidad de que Ang-(1-9) sea un potencial agente terapéutico para tratar enfermedades vasculares

During progression and development of cardiovascular diseases (CVD), particularly those associated with blood vessels, vascular smooth muscle cells (VSMC) change their phenotype from differentiated to a dedifferentiated phenotype. Dedifferentiated VSMC are characterized by increased proliferation, migration and extracellular matrix secretion. This phenotype is responsible for narrowing and fibrosis of the artery wall, which exacerbates the vascular lesion. Several agents have been described to trigger VSMC dedifferentiation, including angiotensin II, platelet-derived growth factor (PDGF) and TNF-α. The renin-angiotensin system (RAS) is a key player in the cardiovascular physiology by controlling vasoconstriction, inflammation and vascular remodeling. This system includes angiotensin I (Ang I), angiotensin I converting enzyme (ACE), angiotensin II (Ang II), and angiotensin II type 1 receptor (AT1R). Deregulation of this system significantly contributes to the CVD physiopathology, mainly due to the action of Ang II on AT1R. In addition, a counter-regulatory RAS has been described, which includes the homologous ACE (ACE2), angiotensin-(1-7) [Ang-(1-7)], angiotensin-(1-9) [Ang-(1-9)] and AT2R. This counter-regulatory RAS has vasodilatory, anti-proliferative, anti-inflammatory and anti-remodeling effects. However, little is known about the direct effects of Ang-(1-9) on VSMCs. To elucidate part of this question, the hypothesis of this study was “Angiotensin-(1-9) prevents PDGF-BB-induced dedifferentiation of vascular smooth muscle cells through the AT2R/Akt/FoxO1 pathway”. The following specific objectives were established: (1) To determine the effect of angiotensin-(1-9) on PDGF-BB induced vascular smooth muscle cell phenotypic change through the AT2 receptor. (2) To evaluate the effect of angiotensin- (1-9) on FoxO1 through the inhibition of Akt in vascular smooth muscle cells. (3) To assess the participation of FoxO1 in the effect of angiotensin-(1-9) on PDGF-BB-induced vascular smooth muscle cell dedifferentiation. This work was carried out using VSMC cell line A7r5 and primary cultures of rat aorta VSMC. Initially, a dose response curve showed that Ang-(1-9) 1 μM was the lower dose showing antagonistic effects against PDGF-BB. Ang-(1-9) alone, did not modify basal proliferation or migration and did not alter the contractile proteins levels. Nevertheless, Ang-(1-9) prevented PAGD-BB induced proliferation measured by cell cycle, nuclear Ki67 expression and cyclin D1. In addition, PDGF-BB induced migration in cells measured by wound healing and transwell assays which was prevented by previous incubation with Ang-(1-9). Finally, PDGF-BB decreased contractile proteins levels (α-SMA, SM22 and calponin) in VSMC, an effect that was prevented by preincubation with Ang-(1-9). All Ang-(1-9) effects were blocked when an AT2R antagonist, such as PD123319, was used. Furthermore, Ang-(1-9) reduced Akt and FoxO1 phosphorylation at 30 min, followed by an increase in total FoxO1 protein levels at 3 hours. All these effects were blocked by PD123319 and by over-expression of Akt-Myr (a constitutively active form of Akt). Finally, the participation of FoxO1 on Ang-(1-9) effects were demonstrated by using a siRNA against FoxO1 or an inhibitor such as AS1842856. On the other hand, FoxO1 adenoviral overexpression mimicked the Ang-(1-9) effects against PDGF-BB. These data suggest that Ang-(1-9) prevents PDGF-BB-induced VSMC dedifferentiation by an AT2R/Akt/FoxO1-dependent mechanism. This work support the possibility that Ang-(1-9) can be used as a potential therapeutic agent to treat vascular diseases