Transmisión glicinérgica y alcoholismo : desarrollo de un vector adenoasociado codificante de una versión mutada (KK385/386AA) de la subunidad Alfa 1 del receptor de glicina

Abstract

El abuso de alcohol genera grandes problemas sociales, económicos y de salud en el mundo. Pese a ello, hay pocos tratamientos farmacológicos para tratar el alcoholismo, los cuales además tienen baja eficacia. Para desarrollar mejores fármacos se necesita conocer los mecanismos moleculares asociados a los efectos del alcohol. El alcohol genera efectos adictivos al activar el sistema mesolímbico dopaminérgico cerebral, aumentando la liberación de dopamina en el núcleo accumbens (nAc). Se cree que la activación del sistema mesolímbico mediada por etanol se debe a la capacidad del etanol de potenciar la función de los receptores de glicina (GlyR) inhibitorios presentes en las neuronas GABAérgicas del nAc. Se ha propuesto que el alcohol potencia la función de GlyR mediante un aumento de la interacción de la subunidad βγ de proteína G (G-βγ) con los dominios intracelulares 385KK386 de la subunidad α1 de GlyR. Aún no se conoce qué circuitos neuronales están asociados a estos efectos, pero se ha encontrado que en nAc se expresa principalmente la subunidad α1 de GlyR. Se dispone de ratones que expresan de forma exclusiva la recombinasa Cre en neuronas GABAérgicas D1 del nAc, por lo que la administración de un vector que codifique para la subunidad α1 mutada de GlyR de forma Cre-dependiente (sistema Cre-loxP) permitiría una expresión específica de la subunidad α1 en este tipo de neuronas. De esta forma, se podría entender de mejor forma el rol de los GlyR presentes en nAc en la toxicidad y efectos adictivos del alcohol. Por lo tanto, se propone la siguiente hipótesis: “La generación de un vector viral adenoasociado (AAV) codificante de la subunidad α1 mutada (KK385/386AA) del receptor de glicina (GlyR), flanqueda por sitios loxP invertidos, permite la expresión específica de un GlyR funcional en células que expresan la recombinasa Cre”. Para ello, en esta tesis se plantean los siguientes objetivos específicos: 1) Introducir mediante mutación sitio dirigida, los cambios aminoacídicos KK385/386AA en el cDNA del gen de la subunidad α1 de GlyR, 2) incorporar los cDNA de los genes silvestre y mutado de GlyRα1 en plásmidos adenoasociados Cre-dependientes y 3) determinar mediante RT-PCR, inmunocitoquímica y electrofisiología, si estos plásmidos expresan una proteína funcional en células en cultivo bajo un contexto Cre

Alcohol abuse generates major social, economic and health problems in the world. Despite this, there are few pharmacological treatments of alcoholism, which also have low efficacy. To develop better drugs, the molecular mechanisms associated to the effects of alcohol must be understood. Alcohol generates its addictive effects by activating the brain dopaminergic mesolimbic system, increasing the release of dopamine in the nucleus accumbens (nAc). It has been suggested that the ethanol-mediated mesolimbic system activation is due to the ability of ethanol to enhance the function of inhibitory glycine (GlyR) receptors present in the GABAergic neurons of nAc. It has been argued that alcohol enhances the function of GlyR by increasing the interaction of the βγ subunit of G protein (G-βγ) with the intracellular domain 385KK386 of the α1 subunit. It is not known which neural circuits are associated with these effects, but it has been found that in nAc the α1 subunit of GlyR is highly expressed. There are available mice expressing exclusively the Cre recombinase in D1 GABAergic neurons of the nAc, consequently the administration of a vector encoding a mutated α1 subunit of GlyR in a Cre-dependent manner (Cre-loxP system) would allow a tissue-specific expression in this type of neurons. Hence, the role of the nAc GlyRs in the toxicity and addictive effects of alcohol could be better understood. Therefore, the following hypothesis is proposed: “The generation of an adeno-associated viral vector (AAV) encoding the mutated α1 subunit (KK385/386AA) of the glycine receptor (GlyR), flanked by inverted loxP sites, allows direct expression of a functional GlyR in cells expressing Cre recombinase”. To this end, the following specific objectives are proposed: 1) To introduce the KK385/386AA amino acid changes by means of a site-directed mutation in the GlyR α1 subunit gene, 2) To incorporate the GlyR wild and mutated genes into Cre-dependent adeno-associated plasmids, and 3) To determine by RT-PCR, immunofluorescence and electrophysiology if these plasmids express a functional protein in cells in culture under a Cre contex