Efectos de resolvina D1 sobre la respuesta inflamatoria inducida por angiotensina II y lipopolisacárido en fibroblastos cardiacos de rata adulta

Abstract

La inflamación en tejido cardíaco es mediadora importante del desarrollo de enfermedades cardiovasculares. En ella, participan los fibroblastos cardíacos (FCs) expresando proteínas de adhesión como ICAM-1 y VCAM-1, secretando citoquinas como IL-6, MCP-1, TNF-α e IL-10, aumentando la adhesión de monocitos a los FCs y con ello la respuesta inflamatoria. La Angiotensina II (Ang II) desencadena una respuesta que induce remodelamiento del tejido cardíaco, caracterizado por fibrosis y es una de las principales causantes de hipertensión arterial, a través de un mecanismo que implica un proceso inflamatorio; sin embargo, sus efectos en FCs no están caracterizados. Por otra parte, LPS es un estímulo proinflamatorio asociado a patógeno cuya respuesta en FCs aumenta la expresión de dichas proteínas de adhesión y citoquinas, además de la adhesión de monocitos. Resolvina D1 (RvD1), mediador lipídico que ha mostrado favorecer la resolución de la inflamación en diferentes modelos experimentales, tanto in vivo como in vitro, no ha sido estudiada en cuanto a sus efectos sobre la respuesta proinflamatoria gatillada por Angiotensina II y LPS en FCs. El objetivo de esta investigación fue determinar los efectos in vitro de RvD1 vía ALX/FPR2 sobre la expresión de las moléculas de adhesión ICAM-1 y VCAM-1, de las citoquinas IL-6, MCP-1, TNF-α, y la adhesión de monocitos, en FCs de rata tratados con LPS y/o Ang II. Para esto se utilizaron cultivos primarios de FCs de ratas adultas. La presencia del receptor ALX/FPR2 se determinó mediante Western Blot (WB), y su funcionalidad a través de la medición de los niveles de cAMP por inmunodetección y los niveles intracelulares relativos de Ca+2 con sonda fluorescente. Los niveles de las citoquinas MCP-1, IL-6, TNF-α se cuantificaron por inmunodetección. Los niveles de ICAM-1 y VCAM-1 se determinaron por WB. Los niveles de expresión (mRNA) de las proteínas de adhesión y citoquinas se determinaron mediante RTqPCR. Finalmente, se realizaron ensayos de adhesión celular de células mononucleares de bazo a FCs. Los resultados más relevantes de esta investigación son: i) detección de receptores ALX/FPR2; ii) RvD1 inhibe el aumento de Ca+2 intracelular gatillado por Ang II. iii) RvD1 por sí sola no modificó los niveles de mRNA y secreción de proteínas de adhesión y citoquinas; iv) Angiotensina II aumentó los niveles de mRNA de IL-6, MCP-1 y TNF-α, la secreción de IL-6 y MCP-1 y la adhesión celular, vía AT1R; v) RvD1 previno estos incrementos en todos los casos excepto para RNAm de TNF-α; vi) RvD1 previno el aumento en los niveles de secreción de IL-6, MCP-1, VCAM-1 y el aumento de la adhesión celular gatillado por LPS. En conclusión, podemos señalar que RvD1 mostró ser capaz de contrarrestar algunos efectos proinflamatorios de Ang II y LPS en FCs, aportando evidencia sobre el rol activo de FCs en el proceso inflamatorio, los que al responder a RvD1 previenen el aumento de proteínas proinflamatorias. Adicionalmente, se abre una posibilidad de evaluar el potencial terapéutico de RvD1 a nivel cardiovascular, debido a su contribución a la resolución de la inflamación e inicio de la reparación del tejido cardíaco dañado

Inflammation in cardiac tissue is an important mediator of the development of cardiovascular diseases. Cardiac fibroblasts (CFs) participate in inflammation, expressing adhesion proteins such as ICAM-1 and VCAM-1 and secreting cytokines such as IL-6, MCP-1, TNF-α and IL-10. These actions allow monocyte adhesion to CFs and concomitantly activation of the inflammatory response. On the other hand, Angiotensin II (Ang II) triggers a response that induces remodeling of heart tissue, characterized by fibrosis, which is one of the main causes of hypertension, through a mechanism involving an inflammatory process. However, the inflammatory effects on CFs are not well characterized. Besides, LPS, a pathogen-associated proinflammatory stimulus increases the expression of adhesion protein and cytokines, and to monocyte adhesion to CFs. Moreover, Resolvin D1 (RvD1), a lipid mediator that has been shown to promote resolution of inflammation in several experimental models, both in vivo and in vitro, has not been studied in terms of the proinflammatory effects triggered by Angiotensin II and LPS on CFs. The main goal of this research was to determine the in vitro effects of RvD1 via ALX/FPR2 on adhesion molecules ICAM-1 and VCAM-1 expression, the cytokines IL-6, MCP-1, TNF-α expression, and the adhesion of monocytes, in rat CFs treated with LPS and/or Ang II. In order to do that, CFs cultures of adult rats from primary cultures were used. The presence of the ALX / FPR2 receptor was determined by Western Blot (WB) and its functionality both, by measuring cAMP levels through immunodetection and relative intracellular levels of Ca+2 with a fluorescent probe. The levels of MCP-1, IL-6, TNF-α, IL-10 were quantified by immunodetection. ICAM-1 and VCAM-1 levels were determined by WB. The expression levels (mRNA) of the adhesion proteins and cytokines were determined by RT-qPCR. Finally, cell adhesion tests of spleen mononuclear cells to CFs were performed. Most relevant results of this research are: i) detection of ALX / FPR2 receptors, ii) RvD1 inhibits the intracellular Ca+ 2 increase triggered by Ang II. iii) RvD1 by itself did not modify levels of mRNA, and secretion of adhesion proteins and cytokines iv) Angiotensin II increases IL-6, MCP-1 and TNF-α mRNA levels, as well as IL-6 and MCP-1 secretion and cell adhesion, via AT1R v) RvD1 prevented these increases in all cases, except for TNF-α mRNA vi) RvD1 prevented increased levels of IL-6, MCP-1, VCAM-1 secretion, and increased LPS-triggered cell adhesion. In conclusion, our results suggest that RvD1 may be able to counteract some proinflammatory effects of Ang II and LPS in CFs, providing evidence on the active role of CFs in the inflammatory process, which when responding to RvD1, prevent the increase of proinflammatory proteins. Additionally, these results bring us the possibility of evaluating the cardiovascular therapeutic potential of RvD1, due to its contribution to the resolution of inflammation and the initiation of repairing of the damaged cardiac tissue