Polimorfismos y expresión génica de IRAK-4 e IRAK-M como marcadores de gravedad de la neumonía adquirida en la comunidad en adultos chilenos

Abstract

La neumonía adquirida en la comunidad (NAC) es una enfermedad pulmonar aguda causada principalmente por virus y bacterias con una elevada morbilidad y mortalidad, en especial en mayores de 65 años. La evolución es entre cuadros clínicos de bajo riesgo y cuadros con riesgo vital. El riesgo de mortalidad de un adulto con NAC se evalúa con escalas pronósticas, como el índice de gravedad de la neumonía (PSI) y CURB65. Aunque poseen buen valor predictor, pueden categorizar erróneamente a algunos pacientes, por tanto, se requieren nuevos biomarcadores que mejoren su capacidad predictora. En estudios previos de perfiles transcripcionales de adultos chilenos con NAC se detectó una expresión diferenciada de los genes de IRAK-4 e IRAK-M. IRAK-4 es una quinasa que promueve la expresión de citoquinas proinflamatorias, mientras que IRAK-M inhibe esta respuesta. Algunos polimorfismos de un nucleótido (SNP) en estos genes se asocian con mayor susceptibilidad a infecciones y menor respuesta inmunológica frente a patógenos. Pese a la importancia de IRAK-4 e IRAK-M en la regulación de la respuesta inmunológica, no se han estudiado en adultos con NAC. La hipótesis de este estudio es: “Adultos chilenos con neumonía adquirida en la comunidad graves presentan genotipos de riesgo en los SNPs rs4251545 de irak-4 y/o rs1152888 de irak-3, con una disminución de la expresión génica de IRAK-4, aumento de la expresión génica de IRAK-M y disminución de la concentración de citoquinas y quimioquinas proinflamatorias en sangre respecto a adultos con neumonía adquirida en la comunidad no graves, constituyendo marcadores con valor pronóstico de gravedad de la NAC”. El objetivo de este estudio fue evaluar si adultos chilenos con NAC graves presentan genotipos de riesgo en los SNPs c.1282G>A (rs4251545) de irak-4 y c.439A>G (rs1152888) de irak-3, disminución de la expresión génica de IRAK- 4, aumento de la expresión génica de IRAK-M y disminución de la concentración de citoquinas y quimioquinas proinflamatorias en sangre respecto a adultos con NAC no graves. Metodología: Se estudiaron 203 adultos con NAC graves y no graves según PSI, CURB65, y evolución (UCI y/o fallecidos). Se detectaron agentes virales y bacterianos en orina e hisopado nasofaríngeo. Se determinó en sangre la genotipificación (n:194) mediante PCR-HRM y la expresión génica relativa (n:169) mediante RT-PCR en tiempo real utilizando el método ΔΔCt. Se cuantificaron las citoquinas plasmáticas relacionadas con la vía de NFκB (RANTES, IL-1β, IL-2, IL-6, GM-CSF, IL-12 (p40 y p70), IL-8, IP-10, MCP-1, MIP-1α, TNF-α y eotaxina) mediante tecnología Luminex® (n=168). Se aplicaron las pruebas estadísticas Chi-Cuadrado, Fisher, Mann-Whitney y Armitage, con los programas Unphased, Graphpad 8 y STATA, siendo significativo si p<0,05. Resultados: El genotipo GG del SNP c.1282G>A de irak-4 fue más frecuente en los casos graves (p<0,03) y el genotipo GA en los casos no graves (p<0,05). El alelo G fue más frecuente en los casos graves y el alelo A en los no graves, pero solo por PSI (p<0,01). Las frecuencias genotípicas y alélicas del SNP c.439A>G de irak-3 y la expresión génica relativa de IRAK-4 e IRAK-M no se asociaron con la gravedad. Las citoquinas y quimioquinas plasmáticas presentaron diferencias según la escala aplicada: en los casos graves según ambas escalas y evolución, los niveles de RANTES e IL-1β fueron menores y mayores los de TNF-α (p<0,04); en los casos graves por PSI los niveles de IL-2, IL-12 (p40 y p70) fueron menores y mayores los de IP-10 (p<0,04); los niveles de GM-CSF y MIP-1α fueron menores en los casos graves por evolución (según PSI) (p<0,01) y mayores los de IL-6 e IL-8 en los casos graves según evolución (y CURB65) (p<0,03). La especificidad y sensibilidad pronóstica de CURB65 aumentaron al incluir el genotipo GA (AOC de 0,83 a 0,88), mientras que las de PSI no se modificaron (AOC de 0,89 a 0,87). Conclusiones: En adultos chilenos con NAC, el genotipo GG y alelo G del SNP rs4251545 (c.1282G>A) de irak-4 se asocian a gravedad mientras que el genotipo GA y alelo A se asocian a menor riesgo de una NAC grave, proponiéndose este SNP como eventual biomarcador de la gravedad de la NAC en adultos chilenos. La expresión génica de IRAK-4 e IRAK-M no se relacionaría con la gravedad de la NAC en adultos chilenos. Las concentraciones plasmáticas de citoquinas varían según la gravedad clínica de los adultos con NAC, disminuyendo RANTES e IL-1β y aumentando TNF-α en los casos graves, lo que disminuiría la respuesta inmunitaria en estos casos, y se relacionaría con el genotipo presente del SNP c.1282G>A de irak-4. Estos resultados sugieren una susceptibilidad genética en el desarrollo de cuadros NAC graves con posibles efectos en la respuesta inmune. Estudios futuros podrían fortalecer el uso de biomarcadores genéticos que mejoren la capacidad discriminatoria de las actuales escalas pronósticas de gravedad en NAC

Community-Acquired Pneumonia (CAP) is a pulmonary acute disease caused mainly by viruses and bacteria with high morbidity and mortality, especially in adults older than 65 years. Its evolution varies from low risk to life-threatening clinical pictures. Mortality risk in adults with CAP is assessed by using prognostic scales, such as the Pneumonia Severity Index (PSI) and CURB-65. Although if they present good predicting values, mistaken categorization of patients may occur. Therefore, finding new biomarkers that enhance the predicting value of these scales is required. In previous studies of Chilean adults with CAP, a differential expression of IRAK-4 and IRAK-M genes was observed. IRAK-4 is a proinflammatory cytokine expression-promoting kinase, meanwhile IRAK-M inhibits this response. Some Single-Nucleotide Polymorphisms (SNP) in these genes have been associated to a higher infection susceptibility and a lower response against pathogens. Despite the importance of IRAK-4 and IRAK-M in the regulation of the immune response, they have not been studied in adults with CAP. The hypothesis of this study is: “Chilean adults with severe Community-Acquired Pneumonia have risk genotypes in SNPs rs4251545 of irak-4 and/or rs1152888 of irak-3, with a lowered IRAK-4 genetic expression, rise of IRAK-M genetic expression and a decline in proinflammatory cytokines and chemokines in comparison to non-severe Community-Acquired Pneumonia diseased adults, constituting CAP prognostic severity value markers”. The main objective of this study was to evaluate if Chilean adults with severe CAP have risk genotypes in SNPs c.1282G>A (rs4251545) of irak-4 and c.439A>G (rs1152888) of irak-3, diminished IRAK-4 genetic expression, increased IRAK-M genetic expression and lowered cytokines and chemokines compared to adults with non-severe CAP. Methods: 203 adults with severe or non-severe CAP according to PSI, CURB65 and evolution (Critical Care Unit or death) were studied. Viral and bacterial agents in urine and nasopharyngeal swab were detected. Genotyping (n:194) was determined in blood using PCR-HRM and relative genetic expression (n:169) by employing real-time RT-PCR applying the ΔΔCt method. Plasmatic cytokines related to the NFκB pathway (RANTES, IL-1β, IL-2, IL-6, GM-CSF, IL-12 (p40 y p70), IL-8, IP-10, MCP-1, MIP-1α, TNF-α and eotaxin) plasmatic levels were quantified with Luminex® technology (n=168). Chi-squared, Fisher, Mann-Whitney and Armitage were applied with softwares Unphased, GraphPad 8 and STATA, being significative if p<0.05. Results: GG genotype c.1282G>A of irak-4 SNP was more frequent in severe cases (p<0.03) and GA genotype in non-severe cases (p<0.05). Allele G was most frequent in severe cases and Allele A in non-severe cases, but only by PSI (p<0.01). Both genotypic and allelic frequencies of the SNP c.439A>G of irak-3 and IRAK-4 and IRAK-M relative genetic expression were not associated to severity of CAP diseased adults. Plasmatic cytokines and chemokines presented differences according to the patient classification scale used: in severe cases defined by both scales and evolution RANTES and IL-1β levels were lower and TNF-α were higher (p<0.04); in severe cases by PSI IL-2, IL-12 (p40 y p70) levels were lower and IP-10 (p<0.04) levels were higher; By evolution (according to PSI), GM-CSF y MIP-1α levels were lower in severe cases (p<0.01 and those of IL-6 e IL-8 were higher in severe cases defined by evolution (and CURB 65) (p<0.03). While both the specificity and sensibility of CURB65 augmented when the GA genotype (AOC from 0,83 to 0,88) was included, those of PSI remained the same (AOC from 0,89 to 0,87). Conclusions: In CAP Chilean adults, GG genotype and SNP rs4251545 (c.1282G>A) of the G allele of irak-4 are associated with severity while the GA genotype and the A allele are associated with a lower risk of severe CAP, Therefore, this SNP is proposed as a possible severity biomarker of CAP in Chilean adults. Genetic expression of IRAK-4 and IRAK-M appear not to be related with severity of CAP in Chilean adults. Plasmatic cytokine concentrations vary according to clinical severity of CAP in adults, RANTES and IL-1β levels are lower, while TNF-α concentrations are higher in severe cases, diminishing the immunity response in these cases; severity also seems related to the presence of the GG genotype at SNP c.1282G>A of irak-4. These results suggest a genetic susceptibility factor in the development of severe CAP cases with possible effects on the immune response. Future studies should strengthen the use of genetic biomarkers in order to enhance the discriminatory capacity of currently used CAP-severity prognostic scales