Implementación de nuevo método de detección de RNA de SARS-CoV-2 alternativo a RT-qPCR, basado en la producción del aptámero de verde de malaquita mediante ligación entablillada de oligonucleótidos específicos y posterior transcripción in vitro

Abstract

A fines del año 2019 el brote de un nuevo coronavirus daría inicio a la pandemia originada por el SARS-CoV-2, agente etiológico de la enfermedad denominada COVID-19. Las políticas en salud pública fueron enfocadas a la toma de decisiones basadas en el número de casos confirmados, donde el RT-PCR en tiempo real (RT-qPCR) corresponde al test de preferencia para la detección, lo que generó una ola de desabastecimiento de insumos y la saturación de los laboratorios habilitados para el procesamiento de las muestras. Frente a la situación descrita, en este proyecto se propuso generar una nueva metodología de detección de RNA viral a través de un método isotérmico e independiente de transcriptasa inversa y DNA polimerasa, empleando la tecnología de aptámeros fluorescentes. Esta propuesta corresponde a un método que se basa en la capacidad de la SplintR ligasa de ligar dos hebras de DNA en heterodúplex con RNA. De este modo, se diseñaron dos oligonucleótidos de modo que al ser ligados en presencia de RNA viral, permiten la transcripción in vitro del RNA aptámero de verde de malaquita, el que fluoresce al unir este compuesto, permitiendo cuantificar el RNA con el que inicialmente los oligonucleótidos formaban el heterodúplex para ser ligado. En este trabajo fue posible generar una alternativa para la detección de RNA empleando la tecnología de aptámeros fluorescentes, relativamente sencilla y más económica al dispensar de algunos reactivos indicados por Yings y cols. (2018). La estandarización de la ligación entablillada, nos permitió determinar las condiciones óptimas de temperatura, tiempo de reacción, concentración de enzima y los efectos inhibitorios de los cationes monovalentes. Por otra parte, los resultados obtenidos muestran que es posible realizar la detección de forma isotérmica y se presenta la posibilidad del monitoreo en tiempo real de la transcripción in vitro y detención de la reacción, en vista a las limitaciones que puede generar el trabajo con un número elevado de muestras. El límite de detección del método estandarizado resultó ser del orden de los nM, muy por encima de la sensibilidad del RT-qPCR. Estos resultados, sumados a la revisión extensiva de la literatura, abren la posibilidad de optimizar las condiciones de reacción en la que se considera el diseño de los oligonucleótidos, reacción de ligación y transcripción in vitro acoplada, además de extender su empleo a la detección de DNA

By the end of 2019, a novel coronavirus outbreak started the COVID-19 pandemic. The etiological agent of the disease is now known as SARS-CoV-2. Public health policies were focused on making decisions based on the number of confirmed cases, where real-time RT-PCR (RT-qPCR) was and still is the prefered test for detection. This high demand generated shortages of supplies and saturated the laboratories enabled to process the samples. Considering this scenario, this project proposes to generate a novel viral RNA detection method through an isothermal and reverse transcriptase/DNA polymerase-independent strategy, using fluorescent aptamer technology. This proposal is based on the ability of SplintR ligase to ligate two DNA strands only when those strands are forming heteroduplexes with a RNA splint. Based on this, two oligonucleotides were designed so that they can be ligated only in the presence of viral RNA they. This ligation allows the in vitro transcription of the malachite green RNA aptamer. The fluorescent complex formed between malachite green and the malachite green aptamer, allows the quantification of the RNA that originaly acts as splint for the DNA ligation. In this work it was possible to generate an alternative for RNA detection using fluorescent aptamer technology. This method is, relatively simple and cheaper tan the standard PCR test, because it does not require some reagents as indicated by Yings et al. (2018). The standardization of the splint ligation allowed us to determine the optimal conditions of temperature, reaction time, enzyme concentration and the inhibitory effects of monovalent cations. Results obtained show that it is possible to carry out the RNA detection under isothermal conditions. It also allows the real-time monitoring of in vitro transcription and stopping of the reaction, An importan advantage when considering the análisis of high numbers of samples. In addition, the detection limit of the standardized method turned out to be of the order of nM, higher than the sensitivity of RT-qPCR. These results, added to the extensive review of the literature, allow optimizing reaction conditions, the design of oligonucleotides, ligation reaction and coupled in vitro transcription, in addition to extending its use for the detection of DNA