Evaluación de miARNs asociados a neuroplasticidad estructural y funcional ante estrés agudo y crónico por restricción de movimiento en hipocampo de rata

Abstract

El estrés es una respuesta fisiológica natural del organismo que ha permitido la evolución y supervivencia. El cerebro recibe e interpreta los estímulos del medio ambiente, comandando respuestas a través de mediadores para mantener la homeostasis. Si este proceso no ocurre de forma eficiente, genera un costo al organismo que al acumularse provocará un sinnúmero de patologías atribuidas al estrés. La respuesta de estrés, inducida por la restricción de movimiento, gatilla la liberación de catecolaminas y glucocorticoides (GCs) a nivel central y periférico, respectivamente. Se ha descrito en roedores que alzas en los niveles de GCs producto de un evento estresor único (agudo), o repetido (crónico) modulan diferencialmente procesos cognitivos asociados en parte al hipocampo; debido a que esta estructura está enriquecida en receptores de GCs. Estos receptores al unirse a su hormona (corticosterona) inducen cambios lentos a nivel de la expresión génica o cambios rápidos provocando un aumento en la liberación del neurotransmisor glutamato. El hipocampo es heterogéneo en sus funciones; Así la porción dorsal participa en procesos como aprendizaje y memoria, en cambio su porción ventral participa en la respuesta de estrés y en las emociones. Estas funciones se llevan a cabo a través de circuitos neuronales glutamatérgicos que incluyen la activación de sus receptores del tipo AMPA y NMDA. A nivel molecular, se observa que la actividad neuronal excitatoria induce traducción local de transcritos a nivel dendrítico produciendo cambios locales en proteínas relacionadas a la regulación del citoesqueleto y de las subunidades de receptores glutamatérgicos. Un mecanismo fino de regulación post-transcripcional involucra la participación de los microARNs (miARNs) cuyos niveles se ven modificados en diversas neuropatologías o enfermedades neurodegenerativas. Además, algunos miARNs regulan los niveles de P250GAP (miR- 132), LimK1 (miR-134) y APT1 (miR-138), proteínas involucradas en mecanismos neuroplásticos al promover cambios estructurales de las espinas dendríticas y por ende en su funcionalidad. Recientemente en el laboratorio, mediante microarreglos se determinaron cambios en los niveles de miARNs en hipocampo dorsal en un modelo de estrés por restricción de movimiento, destacando el miR- 92a y miR-485; ambos involucrados en la modulación de las sinapsis excitatorias. De especial relevancia fue el miR-92a, altamente conservado entre vertebrados e invertebrados y cuya expresión se asocia a dos clúster (cromosoma 13 y X). Más aún, es de alta expresión en neuronas glutamatérgicas y está enriquecido en el axón. Tiene como blancos relevantes a transcritos neuronales como el factor potenciador específico de miocitos isoforma 2D (MEF2D), la proteína de unión al elemento de poliadenilación citoplasmático isoforma 3 (CPEB3), el cotransportador neuronal de Cl– y K+ (KCC2), la subunidad del receptor AMPA (GluR1), entre otros. En base a estos antecedentes, se propuso la siguiente hipótesis: “Los miR-132, miR-134 y miR-138 asociados a plasticidad estructural y los miR-92a y miR-485 que regulan la sinapsis excitadoras, cambian diferencialmente sus niveles en el hipocampo de rata en respuesta a estrés por restricción de movimiento”. Para el modelo de estrés agudo, se utilizaron hipocampos completos de ratas macho sometidas a sesiones de 0,5 o 2,5 h de restricción por movimiento, sacrificándose inmediatamente después. Se determinó mediante qPCR que los niveles de miR-92a aumentaron a las 2,5 h. Adicionalmente se evaluaron los efectos posteriores (6 y 24 h) a una sesión de estrés agudo (2,5 h). Se observó que el miR-92a aumentó luego de 6 h y en cambio el miR-134 incrementó a las 24 h. Para el modelo de estrés crónico, se realizaron sesiones de restricción (2,5 h) durante 14 días y se observó una disminución significativa en los niveles del miR-92a. Para determinar si los cambios observados están relacionados a una acción directa o indirecta de los GCs, se extirparon las glándulas adrenales (ADX) para eliminar la producción de los GCs. La restitución de la corticosterona (i.p.) incrementó los niveles del miR- 92a 0,5 h posterior a la administración en comparación a animales ADX. Más aún, este incremento fue prevenido al antagonizar el receptor NMDA con MK-801, sugiriendo una acción indirecta de los GCs sobre los niveles de este miARN. Adicionalmente, se realizaron análisis in silico para determinar blancos putativos del miR-92a, sugiriendo a KCC2, MEF2D, KAT2B y REST como altamente probables. Se llevaron a cabo ensayos de reportero de luciferasa en células HEK293T, las que presentan altos niveles de miR- 92a. Se determinó que la inserción en el reportero de la secuencia blanco de este miARN presente en el mARN del factor transcripcional silenciador de RE-1 (REST), produjo una reducción en la actividad de la luciferasa. En base a esto, postulamos al mARN de REST como posible blanco del miR-92a. En esta memoria se demuestra que efectivamente los miARNs son diferencialmente modulados en respuesta a estrés por restricción por movimiento tanto agudo (miR-134, miR-92a) como crónico (miR- 92a). Más aún, se demostró que los niveles de miR-92a están indirectamente regulados por los GCs a través de la señalización mediada por el receptor NMDA. Además proponemos a REST como un probable blanco de miR-92a, destacando el hecho de que este factor transcripcional está involucrado en la mantención de las funciones cognitivas durante el envejecimiento y por tanto, su reducción podría estar relacionada a respuestas compensatorias frente al estrés comandadas por el miR-92a

Stress is a natural physiological response of the body that has allowed evolution and survival. The brain receives and interprets environmental stimuli, commanding responses through mediators to maintain homeostasis. If this process does not occur efficiently, a number of diseases attributed to stress can be triggered. The stress response induced by the restriction of movement, elicits the release of catecholamines and glucocorticoids (GCs) at the central and peripheral level, respectively. Increases in levels of GCs in rodents product of a single (acute) or repeated (chronic) stressor event differentially modulate cognitive processes in part associated to the hippocampus, because this structure is enriched in GCs receptors. These receptors induce slow changes at the level or gene expression or rapid changes related to an increase in the release of the glutamate neurotransmitter by binding to its hormone (corticosterone). The hippocampus is heterogeneous in its functions: the dorsal portion is involved in processes such as learning and memory; the ventral portion is involved in stress response and emotions. These functions are performed through glutamatergic neuronal circuits that include activation of NMDA and AMPA type receptors. At the molecular level, neuronal excitatory activity induces local translation of mRNAs at the dendrites producing local changes in proteins related to the regulation of the cytoskeleton and the subunits of glutamate receptors. A fine-tunning mechanism of gene expression is related to microRNAs (miRNAs) that are modified in various neuropathologies and neurodegenerative diseases. In addition, some miRNAs regulate the levels of p250GAP (miR-132), LimK1 (miR-134) and APT1 (miR-138) proteins involved in neuroplastic processes, promoting structural changes of dendritic spines and therefore their functionality. Recently in our laboratory, we determined changes in miRNA levels in the dorsal hippocampus, using a stress model by restriction of movement. Using microarrays, increases were detected primarily in the levels of miR-92a and miR-485 that are involved in the modulation of excitatory synapses. Of particular importance is the fact that miR-92a is highly conserved among vertebrate and invertebrates; in rats this miRNA is present in two copies as part of two clusters for several miRNAs in two chromosomal locations (chromosomes 13 and X). It is highly expressed in glutamatergic neurons and is enriched in the axon of these neurons, and its relevant neural specific targets are the myocyte enhancer factor isoform 2D (MEF2D), the cytoplasmic polyadenylation element binding protein isoform 3 (CPEB3), the neuronal K+/Cl- cotransporter (KCC2) and the AMPA receptor subunit (GluR1), among others. Based on this background, the following hypothesis is proposed: "The miRNAs 132, 134 and 138 are associated with structural plasticity, while miR-92a and 485 regulate the excitatory synapses, differentially changing their levels in the rat hippocampus in response to stress by restriction of movement." For the acute stress model, male rats were subjected to sessions of 0.5 or 2.5 h of movement restraint, immediately sacrificed and the different miRNAs analyzed in the hippocampus. Increased levels of miR- 92a were detected at 2.5 h by qPCR. Additionally, post- stress effects were evaluated (at 6 and 24 h) after an acute stress (2.5 h) session. It was observed that miR-92a increased after 6 h, while miR-134 increased at 24 h. For the chronic stress model, single sessions (2.5 h) of movement restriction were performed for 14 days, observing a significant decrease in miR-92a levels. To determine whether the observed changes are related to the direct or indirect action of GCs, adrenal glands were removed (ADX) to eliminate the production of GCs. The restoration of corticosterone (i.p.) produced an increase of miR-92a levels 0.5 h after administration of this hormone, compared to ADX animals. Furthermore, this increase was prevented by antagonizing the NMDA receptor with MK-801, suggesting an indirect action of GCs on the levels of this miRNA. Additionally, in silico analyses were performed to determine putative targets of miR- 92. Predictions suggested that KCC2, MEF2D, KAT2B and REST as highly probable targets. Luciferase reporter assays were conducted in HEK293T cells that have high levels of miR-92a. These assays showed that the insertion of the miRNA target sequence present in the mRNA of the transcriptional silencer RE- 1 (REST) produced a reduction of luciferase activity. Based on this, we propose that the mRNA of REST is a potential target of miR-92a. Herein it is shown that miRNAs are indeed differentially modulated in response to acute (miR-134, miR- 92a) and chronic (miR-92a) stress by restriction of movement. Furthermore, it was shown that miR-92a levels are indirectly regulated by GCs through signaling mediated by the NMDA receptor. We further propose REST as a putative target of miR-92a, highlighting the fact that this transcription factor is involved in maintaining cognitive functions during aging, and therefore its reduction could be related to compensatory responses to stress commanded by miR-92a