Desarrollo de un método analítico para la determinación de defensina-1 en miel de abeja, como apoyo en la evaluación de su capacidad antimicrobiana

Abstract

Entre los vectores de polinización animal de las plantas consumidas por el ser humano, la abeja melífera (Apis mellifera) es el de mayor relevancia, ya que poliniza alrededor de un 70% de estas; con una valorización aproximada de 190 billones de USD anuales a nivel mundial. Además, desde esta misma perspectiva este insecto es fundamental para mantener los ecosistemas naturales. Sin embargo, desde el 2006 A. mellifera ha experimentado un marcado descenso en su población, causado por la desaparición de las abejas obreras adultas de la colmena y el colapso de esta, fenómeno denominado Síndrome del Colapso de la Colmena (SCC); el que ha sido asociado a variados factores estresores como pesticidas, parásitos y patógenos actuando en conjunto. La importancia de A. mellifera y las presiones ambientales que está experimentando han llevado a estudiar de manera exhaustiva a la especie. Para enfrentar los citados estresores y debido a su naturaleza social, A. mellifera ha desarrollado diversos mecanismos de inmunidad social, entre los cuales se destaca la secreción del péptido antibacteriano defensina-1 (péptido catiónico, rico en cisteínas con actividad principalmente contra bacterias Gram-positivas) desde glándulas exocrinas hacia los alimentos de la colmena: la jalea real y la miel. Esta última es reconocida por su actividad antibacteriana, antiviral y antifúngica y por ello se ha propuesto su uso en medicina clínica. Además de la defensina-1 hay varios factores responsables de la actividad antibacteriana de la miel (alta osmolaridad, pH ácido, generación de peróxido de hidrógeno). Sin embargo, son limitados los reportes sobre la determinación del péptido en la miel y dado que es uno de los principales factores que le otorgan su capacidad antibacteriana, representa un buen biomarcador para caracterizar y verificar la calidad del producto. Para determinar defensina-1 en miel se ha propuesto la inmunoadsorción ligada a enzima (ELISA). Aunque este método es específico y bastante sensible, el reconocimiento inmunológico solo considera una parte de la estructura del péptido, lo que podría conducir a una pérdida de información sobre la presencia de diferentes especies, incluida una posible forma glicada de defensina-1. Bajo esta perspectiva, tener métodos de análisis con bases químicas de separación, detección y cuantificación de defensina-1 en la miel, podría representar un apoyo complementario a los estudios que requieren los actuales desafíos apícolas. En la presente tesis se propone desarrollar una metodología con bases químicas de separación, detección y cuantificación de defensina-1 en miel, basada en su extracción en fase sólida con intercambio catiónico débil (SPE-WCX), teniendo en cuenta su composición básica de aminoácidos; para luego determinarla por cromatografía líquida de alta rendimiento en fase reversa de pares iónicos (IP-RP-HPLC), acoplada a un detector de fluorescencia en serie con un detector de arreglo de diodos. La hipótesis propuesta es: “La miel de abeja de la especie Apis mellifera producida en la zona centro-sur de Chile, presenta defensina-1 en cantidades cuantificables mediante el método analítico desarrollado”. Mientras que el objetivo general de esta tesis fue: “Desarrollar un método analítico para cuantificar defensina-1 en la miel, mediante SPE-WCX asociada a IP-RP-HPLC-FD”. En primer lugar, se obtuvo defensina-1 recombinante (empleada como patrón) mediante inducción de Ubiquitina-defensina-1 utilizando isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG). Se purificó la defensina-1 recombinante mediante cromatografía de afinidad asociada a ion metálico (IMAC), en un medio denaturante y reductor, y posterior cromatografía por exclusión molecular. Como resultado del proceso se obtuvo aproximadamente 1,25 mg de péptido por litro de medio de cultivo. Se verificó la identidad de la proteína purificada mediante cromatografía líquida asociada a espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS); con un 100% de coincidencia con la secuencia aminoacídica y un peso de 5.560 Da, muy similar al peso teórico de la isoforma utilizada para este estudio (5.525 Da). Posteriormente se caracterizó a la defensina-1 recombinante por espectroscopía de fluorescencia total. Los espectros de fluorescencia total del péptido arrojaron máximos de excitación/emisión a 220/360 nm y 280/360 nm, asociados al residuo de triptófano presente en la defensina-1 recombinante. Se construyó una curva de calibrado con el valor de fluorescencia obtenido a 280/360 nm de longitud de onda de excitación/emisión (λexc/λem); obteniéndose un R2 = 0,9902; corroborando la relación entre la concentración del péptido y su fluorescencia. Se implementó un método para la detección-cuantificación de la defensina-1 mediante IP-RP-HPLC-FD. Para ello se usó una elución isocrática 80% fase A (Acetonitrilo y Betamercaptoetanol (βME) 10 mM) y 20% fase B (Agua ultrapura y βME 10 mM) en una columna C18 de 150 mm de largo y 4,6 mm de diámetro (Aeris™ 3,6 μm PEPTIDE XB-C18 100 x 21 mm). Previo a su inyección, las muestras fueron incubadas por 1 hora a temperatura ambiente con ácido trifluoroacético (TFA) y βME para la reducción del péptido. Bajo estas condiciones, la defensina-1 recombinante presentó un único pico cromatográfico a los 1,55 minutos. Se construyeron dos curvas de calibrado de baja (2,9 a 11 μM) y alta concentración (11 a 81,36 μM); con valores de R2 de 0,9628 y 0,9828, respectivamente. Los LOD y LOQ fueron 2,2 μM y 6,6 μM, respectivamente. Luego, se desarrolló una metodología basada en SPE-WCX para extraer la defensina-1 desde la miel. Los extractos obtenidos fueron analizados inicialmente mediante espectroscopía de fluorescencia total con el fin de evaluar la recuperación de la defensina. Sin embargo, no se obtuvieron resultados concluyentes debido a la variedad de señales de fluorescencia observadas. Por ello se evaluó el resultado del proceso mediante IP-RP-HPLC-FD. La defensina-1 recombinante pura sometida a SPE-WCX presentó un pico cromatográfico a los 1,55 minutos y dos picos adicionales a los 1,79 y 2,23 minutos; atribuibles a especies de defensina-1 recombinante con una conformación distinta producto de la reducción y re-oxidación de los enlaces disulfuro de su estructura, producidos durante el proceso de purificación y/o separación. Por su parte, las muestras de miel sometidas SPE-WCX presentaron igualmente un pico cromatográfico a los 1,55 minutos asociado al péptido y el mismo pico adicional a los 1,79 minutos, parcialmente solapado al pico de la defensina-1; atribuible a una especie de defensina-1 con una conformación distinta como se mencionó anteriormente. Esto indica la necesidad de una incubación de las muestras con un reductor, previa a su análisis por HPLC Finalmente se determinó la concentración de defensina-1 en cinco mieles provenientes de la zona central del país, obteniéndose valores entre 26,5 ± 0,4 y 60 ± 2 μg de defensina-1 / g de miel; con coeficientes de variación entre 0,7 y 3,0%, lo que demuestra la buena repetitividad del método desarrollado. Se concluye así, que se desarrolló un método basado en SPE-WCX asociado a HPLC-FD el que permitió detectar y cuantificar defensina-1 en mieles chilenas y confirmar la hipótesis propuesta. Este permitirá complementar el estudio de la miel relacionado con la presencia del péptido y su capacidad antimicrobiana y/o avalar el uso de la miel en otras dimensiones, más allá del consumo humano. Cabe señalar que se requieren hacer algunos ajustes al método desarrollado para dar mayor certeza a la determinación del péptido

Among the animal pollination vectors of plants consumed by humans, the honeybee (Apis mellifera) is the most relevant, since it pollinates about 70% of these plants, with an approximate value of 190 billion USD per year worldwide. Furthermore, from this same perspective, this insect is fundamental to maintain natural ecosystems. However, since 2006 A. mellifera has experienced a marked decline in its population, caused by the disappearance of adult worker bees from the hive and the collapse of the hive, a phenomenon called Colony Collapse Disorder (CCD), which has been associated with various stressors such as pesticides, parasites and pathogens acting together. The importance of A. mellifera and the environmental pressures it is experiencing have led to an exhaustive study of the species. To cope with these stressors and due to its social nature, A. mellifera has developed several social immunity mechanisms, among which is the secretion of the antibacterial peptide defensin-1 (a cationic peptide, rich in cysteines with activity against Gram-positive bacteria), from exocrine glands to the hive food: royal jelly and honey. The latter is recognized for its antibacterial, antiviral and antifungal activity and has therefore been proposed for use in clinical medicine. In addition to defensin-1 there are several factors responsible for the antibacterial activity of honey (high osmolarity, acid pH, hydrogen peroxide generation). However, there are limited reports on the determination of the peptide in honey, and since it is one of the main factors that give honey its antibacterial activity, it represents a good biomarker to characterize and verify the quality of the product. Enzyme-linked immuno-adsorption assay (ELISA) has been proposed to determine defensin-1 in honey. Although this method is specific and quite sensitive, the immunological recognition only considers a part of the peptide structure, which could lead to a loss of information about the presence of different species, including a possible glycated form of defensin-1. Under this perspective, having methods of analysis with chemical bases of separation, detection and quantification of defensin-1 in honey, could represent a complementary support to the studies required by the current beekeeping challenges. The present thesis proposes a chemically based methodology for the separation, detection and quantification of defensin-1 in honey, based on weak cation exchange with solid phase extraction (WCX-SPE), considering its basic amino acid composition, and then determining it by ion-pair reversed-phase high performance liquid chromatography (IP-RP-HPLC), coupled to a fluorescence detector in series with a diode array detector. The proposed hypothesis is: "Bee honey of the Apis mellifera species produced in the central-southern zone of Chile, presents defensin-1 in mensurable quantities by means of the analytical method developed". While the general objective of this thesis was: "To develop an analytical method to quantify defensin-1 in honey, by means of WCX-SPE associated to IP-RP-HPLC-FD". First, recombinant defensin-1 (used as a standard) was obtained by induction of Ubiquitin-defensin-1 using isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). Recombinant defensin-1 was purified by immobilized metal affinity chromatography (IMAC) in a denaturing and reducing medium, followed by size exclusion chromatography. As a result of the process, approximately 1,25 mg of peptide was obtained per liter of culture medium. The identity of the purified protein was verified by liquid chromatography with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS); with a 100% fit in the amino acid sequence and a weight of 5,560 Da, very similar to the theoretical weight of the isoform used for this study (5,525 Da). Recombinant defensin-1 was then characterized by total fluorescence spectroscopy. Total fluorescence spectra of the peptide yielded excitation/emission maxima at 220/360 nm and 280/360 nm, associated with the tryptophan residue present in the recombinant defensin-1. A calibration curve was constructed with the fluorescence value obtained at 280/360 nm (λexc/λem); obtaining an R2 = 0,9902; corroborating the relationship between peptide concentration and its fluorescence. A method for the detection-quantification of defensin-1 by IP-RP-HPLC-FD was implemented. For this purpose, an isocratic elution of 80% phase A (acetonitrile and βME 10 mM) and 20% phase B (ultrapure water βME 10 mM) on a C18 column of 150 mm length and 4.6 mm diameter (Aeris™ 3.6 μm PEPTIDE XB-C18 100 x 21 mm) was used. Prior to injection, samples were incubated for 1 h at room temperature with TFA and βME for peptide reduction. Under these conditions, recombinant defensin-1 presented a single chromatographic peak at 1,55 minutes. Two calibration curves were constructed for low (2,9 to 11 μM) and high concentration (11 to 81,36 μM); with R2 values of 0,9628 and 0,9828, respectively. The LOD and LOQ were 2,2 μM and 6,6 μM, respectively. An SPE-WCX based methodology was developed to extract defensin-1 from honey. The extracts obtained were initially analyzed by total fluorescence spectroscopy in order to evaluate the recovery of defensin. However, no conclusive results were obtained due to the variety of fluorescence signals observed. Therefore, the outcome of the process was evaluated by IP-RP-HPLC-FD. The pure recombinant defensin-1 subjected SPE-WCX presented a chromatographic peak at 1,55 minutes and two additional peaks at 1.79 and 2.23 minutes; attributable to recombinant defensin-1 species with a different conformation as a result of the reduction and re-oxidation of the disulfide bonds of its structure produced during the purification and/or separation process. For their part, the honey samples subjected to SPE-WCX also presented a chromatographic peak at 1,55 minutes associated with the peptide and the same additional peak at 1,79 minutes, partially overlapping the defensin-1 peak; attributable to a defensin-1 species with a different conformation as previously mentioned. This indicates the need for incubation of the samples with a reducing agent prior to HPLC analysis. Finally, the concentration of defensin-1 was determined in five honeys from the central zone of the country, obtaining values between 26,5 ± 0,4 and 60 ± 2 μg of defensin-1 / g of honey; with coefficients of variation between 0,7 and 3,0%, which shows the good repeatability of the developed method. It is thus concluded that a method based on SPE-WCX associated to HPLC-FD was developed, which allowed the detection and quantification of defensin-1 in Chilean honeys, thus confirming the proposed hypothesis. This will allow complementing the study of honey related to the presence of the peptide and its antimicrobial capacity and/or endorsing the use of honey in other dimensions, beyond human consumption. It should be noted that some adjustments need to be made to the method developed to give greater certainty to the determination of the peptide