Análisis teórico-bioinformático de una enzima con potencial actividad α-glucuronidasa del hongo Gloeophyllum trabeum y clonamiento del gen

Abstract

Este seminario tuvo el objetivo de estudiar la estructura de una potencial α-glucuronidasa del hongo G. trabeum usando métodos bioinformáticos, así como también clonar la secuencia de DNA codificante de su gen correspondiente en E. coli. Se realizó una revisión bibliográfica y un análisis del sitio activo de la familias de glicosil hidrolasas GH67 y GH115. Para la primera familia, tanto el mecanismo catalítico como especificidad de sustrato se encuentran bien caracterizados, sin embargo, para la familia GH115 tales características no se encuentran totalmente definidas. Los factores determinantes del mecanismo catalítico y la especificidad de sustrato de la familia GH115 podrían asociarse a cómo se mueve un loop móvil del sitio catalítico y a la composición y forma del surco catalítico. Se obtuvo un modelo por homología monomérico de una enzima con posible actividad α-glucuronidasa de G. trabeum (XP_007865968.1), denominada en este trabajo como Gt115, el cual fue refinado hasta que la geometría de la mayoría de los residuos se encontrara sobre del estándar mínimo geométrico para su confiabilidad. El modelo de Gt115 mostró una estructura de 5 dominios y un sitio catalítico con aminoácidos conservados en posiciones idénticas propios de la familia GH115. Gt115 muestra un surco catalítico largo cuyos residuos clave presentan rotaciones ω no observadas en sus contrapartes bacterianas, lo que podría implicar afinidad por sustratos más largos y una interacción con el sustrato distinta a lo visto en otras α-glucuronidasas de la misma familia. Desde un cultivo de G. trabeum crecido en alfalfa se aisló un fragmento de DNA del tamaño correspondiente a la secuencia de DNA codificante para Gt115. El fragmento se intentó ligar al vector pJET 1.2/Blunt y posteriormente clonar el producto de ligación en Escherichia coli DH5α sin éxito, hecho atribuido principalmente a una ligación no exitosa, y a que el marcador de selección secundaria del vector de clonación se encontraba no funcional. Para confirmar la expresión del gen de Gt115 en G. trabeum se deberá secuenciar el fragmento de ADN de 3000 pb aislado por RtPCR.

The aim of this seminar was to study the structure of a potential α-glucuronidase from the fungus G. trabeum using bioinformatics methods, as well as to clone the transcript of its corresponding gene in E. coli. A literature review and active site analysis of the GH67 and GH115 families of glycosyl hydrolases was performed. For the first family, both the catalytic mechanism and substrate specificity are well characterized, however, for the GH115 family such characteristics are not fully defined. The determinants of the catalytic mechanism and specificity of the GH115 family could be associated with how a mobile loop moves through the catalytic site and the composition and shape of the catalytic groove. A monomeric homology model of an enzyme with possible α-glucuronidase activity from G. trabeum (XP_007865968.1), referred to in this work as Gt115, was obtained and refined until the geometry of most residues was above the minimum geometric standard for reliability. The model of Gt115 showed a 5-domain structure and a catalytic site with conserved amino acids in identical positions characteristic of the GH115 family. Gt115 presents a long catalytic groove whose key residues present ω-rotations not observed in its bacterial counterparts, which could imply affinity for longer substrates and an interaction with the substrate different from that seen in other α-glucuronidases of the same family. A DNA fragment of the size corresponding to the sequence of the transcript coding for Gt115 was isolated from a culture of G. trabeum grown on alfalfa. The fragment was attempted to ligate into the pJET 1.2/Blunt vector and subsequently clone the ligation product into Escherichia coli DH5α without success, a fact mainly attributed to unsuccessful ligation, and to the secondary selection marker of the cloning vector being non-functional. To confirm the expression of the Gt115 gene in G. trabeum, the 3000 bp DNA fragment isolated by RtPCR should be sequenced.