Desarrollo de un carrier lipídico nanoestructurado como sistema gastroretentivo para el reconocimiento y posterior unión covalente a mucina gástrica mediante transglutaminasa 2

Abstract

Diferentes patologías pueden afectar al estómago incluyendo enfermedades inflamatorias, reflujo e infecciones. En particular, debido al constante daño que producen estas enfermedades y al complejo tratamiento para una recuperación, es que son un factor que llevan a la aparición de cáncer. Para el tratamiento de estas patologías, se han investigado diferentes tipos de formulaciones para administrar los fármacos requeridos, como formulaciones flotantes, de alta densidad o mucoadhesivas. Sin embargo, estos no apuntan a generar una interacción y reconocimiento específico con la zona dañada y proporcionar una liberación local. De esta manera, las terapias que propician la adhesión a la mucosa gástrica han tenido limitado éxito clínico. Considerando la fisiología estomacal, uno de los principales componentes del moco gástrico es la mucina, siendo específicamente el fenotipo 1 (MUC1) la que se encuentra anclada en el epitelio. Las mucinas son glicoproteínas de gran tamaño con funciones fisiológicas relacionadas con la citoprotección, protección mecánica, mantención de la viscosidad en las secreciones y reconocimiento celular. Por lo tanto, cumple un rol importante en cuanto a la protección del epitelio frente a diversos factores. Por otra parte, en el contenido gástrico se encuentran diferentes enzimas, incluyendo la Transglutaminasa 2 (TG2). Esta enzima cataliza múltiples reacciones, como la unión covalente de residuos de glutamina con residuos de lisina, formando un enlace isopeptídico ε(c-glutamil)lisina, por lo tanto, esta enzima puede reconocer los residuos de glutamina presentes en la estructura de MUC1. Por ende, en un daño gástrico las mucinas se encontrarán expuestas y en conjunto a un aumento en la expresión de TG2, puede ser utilizado como estrategia para acercar localmente y de manera dirigida una terapia mediante el reconocimiento de TG2 para sanar el daño gástrico. Por lo tanto, en este trabajo se propone estudiar un mecanismo enzimático que permita unir covalentemente un sistema nanopartículado modificado superficialmente con un péptido a la mucosa gástrica mediante TG2. De esta manera, se permitirá aumentar la permanencia de este nanosistema en la zona específica de la lesión. Para esto, se utilizó un carrier lipídico nanoestructurado porque han mostrado una mejorada capacidad de carga de fármaco y propiedades de liberación, estabilidad, biocompatibilidad y biodisponibilidad respecto a otros materiales. Los resultados obtenidos muestran que se fabricó un carrier lipídico nanoestructurado (NLC) cargado con claritromicina (CLA) de tamaño adecuado para mejorar la permanencia en la cercanía de la mucosa gástrica y coloidalmente estable. Los estudios de liberación muestran que CLA alcanza una liberación de ~ el 80%, 35% y 30% a pH 5,5, 3,0 y 8,0, respectivamente. Adicionalmente, se estableció una metodología de mucoadhesión que permitió confirmar el reconocimiento de TG2 al péptido y que el enlace formado entre mucina y el péptido es de tipo covalente. Por otra parte, la conjugación superficial del péptido en el NLC mediante una reacción de Steglich fue de un 62% aproximadamente, lo que permite mantener un efectivo reconocimiento de TG2 al péptido conjugado al NLC. Adicionalmente, se realizaron estudios antimicrobianos en microdilución en caldo y difusión en disco que mostraron que NLC-CLA tiene un mejor comportamiento en comparación a CLA libre contra Helicobacter pylori (ATC 26695). Finalmente, se realizaron estudios de viabilidad celular en una línea celular representativa de epitelio gástrico a todos los nanosistemas fabricados, obteniendo como resultado que ninguno afecta a la viabilidad celular. De esta manera, la presenta tesis aporta con un estudio de desarrollo y fabricación de un nanosistema capaz de ser reconocido por un factor fisiológico, además, con propiedades antimicrobianas que no afectan la viabilidad celular en las concentraciones evaluadas

Different pathologies can affect the stomach including inflammatory diseases, reflux, and infections. In particular, due to the constant damage caused by these diseases and the complex treatment for their recovery, they are a factor that leads to the appearance of cancer. For the treatment of these pathologies, different types of gastroretentivo formulations have been investigated to administer drugs, such as floating, high-density or mucoadhesive formulations. However, these are not intended to generate specific recognition and interaction with the damaged area and provide local release. Therefore, therapies that promote adhesion to the gastric mucosa have had limited clinical success. In stomach physiology, one of the main components of gastric mucus is mucin, specifically phenotype 1 (MUC1) which is anchored in the epithelium. Mucins are glycoproteins with physiological functions related to cytoprotection, mechanical protection, maintenance of secretion viscosity, and cell recognition. Therefore, it plays an important role in protecting the epithelium against various factors. On the other hand, different enzymes are found in the gastric content, including Transglutaminase 2 (TG2). This enzyme catalyzes multiple reactions, such as the covalent bonding of glutamine residues with lysine residues, forming an ε(c-glutamyl)lysine isopeptide bond, therefore, this enzyme can recognize glutamine residues present in the MUC1 structure. Therefore, in gastric damage the mucins will be exposed and together with an increase in the expression of TG2, it can be used as a strategy to approach locally and in a targeted manner a therapy through the recognition of TG2 to cure gastric damage. Therefore, in this work it is proposed to study an enzymatic mechanism that allows covalently binding a system of surface-modified nanoparticles with a peptide to the gastric mucosa through TG2. In this way, it will be possible to increase the permanence of this nanosystem in the specific area of the lesion. For this, a nanostructured lipid carrier was used because they have shown better drug loading capacity and release properties, stability, biocompatibility and bioavailability compared to other materials. The results obtained show that a nanostructured lipid carrier (NLC) loaded with clarithromycin (CLA) of adequate size to improve the permanence in the vicinity of the gastric mucosa and colloidally stable was manufactured. Release studies show that CLA achieves ~80%, 35%, and 30% release at pH 5.5, 3.0, and 8.0, respectively. Additionally, a mucoadhesion methodology was established that confirmed the recognition of TG2 to the peptide and that the bond formed between the mucin and the peptide is covalent. On the other hand, the surface conjugation of the peptide in the NLC by Steglich reaction was approximately 62%, which allows maintaining an effective recognition of TG2 to the peptide conjugated to the NLC. Additionally, antimicrobial studies were carried out in broth microdilution and disc diffusion that showed that NLC-CLA has a better behavior against free CLA against Helicobacter pylori (ATC 26695). Finally, cell viability studies were carried out on a representative cell line of the gastric epithelium for all the manufactured nanosystems, obtaining as a result that none affected cell viability. In this way, this thesis contributes with a study of the development and manufacture of a nanosystem capable of being recognized by a physiological factor, in addition, with antimicrobial properties that do not affect cell viability in the concentrations evaluated