Caracterización microbiológica y funcional de una cepa mutante de Streptococcus agalactiae knockout para el gen sip

Abstract

Steptococcus agalactiae (Streptococcus Grupo B), es el principal agente causante de sepsis y meningitis bacteriana en recién nacidos. Dentro de la especie se describen 10 serotipos (Ia, Ib, II al IX) basados en el antígeno capsular de su superficie. La portación de esta bacteria en los tractos gastrointestinales y genitourinario femenino constituyen el principal factor de riesgo para la enfermedad invasora por S. agalactiae en los recién nacidos. Adicionalmente, esta bacteria puede provocar parto prematuro o muerte fetal cuando la infección asciende desde la vagina hasta a alcanzar el feto. Por lo anterior, se están desarrollando prototipos de vacunas dirigidas a las gestantes que permitan disminuir la enfermedad de inicio tardío, para lo cual distintos blancos están siendo utilizados. Uno de esos blancos es la proteína inmunogénica de superficie (Sip), la cual está presente en todos los serotipos de S. agalactiae. La proteína Sip es un buen inmunógeno y adyuvante, de acuerdo a estudios realizados a nivel preclínico en la Sección Biotecnología del Instituto de Salud Pública de Chile (ISPCH). Además, el gen que la codifica ha demostrado ser un excelente blanco para la detección de la especie mediante PCR en tiempo real, dado su alto porcentaje de similitud en su composición nucleotídica entre las diferentes cepas, evidenciada por su alta sensibilidad y especificidad, como resultado de la validación analítica. A la fecha, la función y la estructura de la proteína Sip es desconocida. Desde la secuencia primaria, se ha determinado que tiene un péptido señal de secreción y un motivo de LysM en el extremo N-terminal, lo cual le permite a la proteína anclarse al peptidoglicano de la pared celular y con ello permanecer en la superficie de la bacteria. Datos aún no publicados por la Sección Biotecnología del ISPCH han demostrado aumento en los niveles de transcritos del gen sip en modelo murino de colonización vaginal. Por lo anterior, en este proyecto se evaluó su potencial rol en la adherencia y/o invasión de células eucariontes in vitro. Para evaluar el rol de la proteína Sip en los mecanismos de adherencia e invasión celular, primeramente, se diseñó in silico un cassette de recombinación basado en un genoma referencia de S. agalactiae (GenBank LS483387.1). El cassette de recombinación estuvo compuesto por las regiones flanqueantes al marco de lectura abierto (ORF) del gen sip; 1000 pb río arriba y 1001 pb río abajo del ORF del gen. Ambas secuencias se unieron al ORF del gen cat, codificante para la proteína cloranfenicol acetiltransferasa, cuya expresión confiere resistencia a Cloranfenicol. La secuencia diseñada y posteriormente sintetizada, fue subclonada en el vector suicida pMBsacB, utilizando los sitios de restricción XhoI y NotI. Se transformó la cepa BIOTEC.ISPCH/2015 de S. agalactiae con el vector pMBsacB-MutSIP (cassette de recombinación subclonado en el vector pBMsacB) y, mediante ensayos de crecimiento en medios de cultivo a temperaturas permisivas y no permisivas para la replicación del vector, se generó la recombinación homóloga, intercambiando por completo el ORF del gen sip por el ORF del gen cat. La cepa BIOTEC.ISPCH/2015 de S. agalactiae mutante sip, fue confirmada mediante secuenciación masiva, evidenciando la ausencia de la secuencia del ORF del gen sip a lo largo del genoma. Además, se realizaron inmunoensayos (western blot y ensayos de flujo lateral) con anticuerpos monoclonales y policlonales anti-rSip, que confirmaron la ausencia de la expresión de Sip en la cepa mutante. Luego, se caracterizó microbiológicamente la cepa mutante sip en términos de su perfil de resistencia a los antimicrobianos, capacidad de expresión del factor CAMP y cinética de crecimiento. Finalmente, el rol de la proteína Sip en mecanismos de adherencia e invasión celular, fue evaluado en un modelo de línea celular HeLa. De acuerdo a lo observado, el número de bacterias recuperadas de los ensayos de adherencia, entre las cepas BIOTEC.ISPCH/2015 de S. agalactiae silvestre y mutante, mostró una diferencia entre ambas estadísticamente significativa, evidenciando que la cepa mutante sip modificó, por disminución, su fenotipo de adherencia respecto de la cepa silvestre. De los ensayos de invasión celular, se observó una tendencia de mayor recuperación de bacterias desde la cepa silvestre respecto de la cepa mutante sip, pero sin una diferencia estadísticamente significativa. La obtención de una cepa de S. agalactiae mutante sip representa un avance en el entendimiento del rol de la proteína Sip para esta especie. Los resultados sugieren que la función de la proteína Sip estaría relacionada con la adherencia de la bacteria en células eucariontes

Streptococcus agalactiae (Group B Streptococcus) is a leading cause of sepsis and meningitis in newborns. According to capsular polysaccharide antigen, 10 distinct serotypes have been described (Ia, Ib, II–IX). The asymptomatic presentation in the gastrointestinal and female genitourinary tracts in pregnant women constitutes the main risk factor for invasive S. agalactiae disease in newborns. Additionally, this bacterium causes preterm labor or fetal death when the infection ascends from the vaginal tract to fetus. To date, prototypes of vaccines aimed at pregnant women are being developed to reduce late-onset disease using different targets as candidates. The surface immunogenic protein (Sip), present on all serotypes of S. agalactiae, has demonstrated to be a suitable vaccine target in a murine model. The Sip protein is an excellent immunogen and adjuvant according to studies carried out in preclinical models at Biotechnology Section in the Health Public Institute of Chile (ISPCH). In addition, the gene encoding the Sip protein has proven to be a good target for the detection of S. agalactiae by real-time polymerase chain reaction (PCR) because of the high percentage of similarity and nucleotide composition among the different strains. Moreover, high sensitivity and specificity were observed in an analytical validation. To date, the function and structure of the Sip protein is unknown. Based on the primary sequence, it has been determined that the protein has a secretion peptide and a LysM motif at the N-terminal, which allow it to anchor to the peptidoglycan of the bacterial cell wall and remain on the bacterial surface. Unpublished data by the Biotechnology Section of ISPCH has shown an increase in levels of sip gene transcripts in a murine model of vaginal colonization. To evaluate the role of the Sip protein in cell adherence and invasion mechanisms, a recombination cassette based on a reference genome of S. agalactiae (GenBank LS483387.1) was first designed in silico. The recombination cassette was composed of the sip gene open reading frame (ORF) flanking regions, 1000 bp upstream and 1001 bp downstream of the sip gene ORF. Both sequences were linked to the ORF of the cat gene and coded for the chloramphenicol acetyltransferase protein, whose expression confers resistance to chloramphenicol. The designed and subsequently synthesized sequence was subcloned into the pMBsacB suicide vector using the XhoI and NotI restriction sites. The BIOTEC.ISPCH/2015 strain of S. agalactiae was transformed with pMBsacB-MutSIP (recombination cassette subcloned in pBMsacB vector) and based on growth assays in culture media at temperatures permissive and non-permissive to vector replication, homologous recombination was generated that completely exchanged the ORF of the sip gene for the ORF of the cat gene. The BIOTEC.ISPCH/2015 strain of S. agalactiae mutant sip was confirmed by massive sequencing, demonstrating the absence of the ORF sequence of sip gene along the genome. In addition, immunoassays (western blot and lateral flow assays) were performed with monoclonal and polyclonal antibodies (anti-rSip protein), which confirmed the absence of Sip expression in the mutant strain. The sip mutant strain was then microbiologically characterized in terms of its antimicrobial resistance profile, CAMP factor expression capacity, and growth kinetics. Finally, the role of the Sip protein in cell adhesion and invasion mechanisms was evaluated in a HeLa cell line model. The number of bacteria recovered from the adherence assays showed a difference of 4,7 fold between the wild-type and mutant sip strains of S. agalactiae, which was estimated as a statistically significant difference. Demonstrating that the sip mutant strain modified its adherence phenotype with respect to the wild-type strain. Based on cell invasion assays, a trend of higher bacterial recovery from the wild-type strain relative to the sip mutant strain was observed but without presenting a statistically significant difference. Obtaining a sip mutant strain of S. agalactiae represents a breakthrough in the understanding of the role of the Sip protein for this species. The results suggest that the function of the Sip protein could be related to bacterial adhesion in eukaryotic cells