Secretoma de células madre mesenquimáticas humanas como tratamiento antioxidante y antinflamatorio de microglías de rata expuestas a opioides

Abstract

El consumo no controlado de opioides se ha convertido en un grave problema de salud pública en el mundo, debido a la dependencia física que estos generan. Las tasas de adicción, recaída al consumo y muertes por sobredosis han aumentado fuertemente en los últimos años, principalmente asociadas al consumo de morfina y fentanilo. La generación de estrés oxidativo y neuroinflamación en el sistema de recompensa cerebral, causados por el uso reiterado de estas drogas de abuso, ha sido fuertemente relacionada con el desarrollo y el mantenimiento de conductas adictivas. El estrés oxidativo y la neuroinflamación reducen la actividad de transportadores de glutamato (principal neurotransmisor excitatorio en el cerebro) presentes en microglías y astrocitos. Esto impide la regulación normal de los niveles de glutamato en el sistema de recompensa, lo que conduce a su sobreactivación patológica, promoviendo conductas que favorecen el consumo y la recaída a la droga. Por esto, son necesarias aproximaciones experimentales que busquen revertir este aumento de estrés oxidativo y neuroinflamación en microglías y astrocitos, y consecuentemente reducir el riesgo de desarrollar una adicción al consumo de opioides. Como posible tratamiento, proponemos una terapia basada en la potente actividad antioxidante y antinflamatoria de las células madre mesenquimáticas humanas (hMSC). Estas células secretan una gran variedad de moléculas con actividad paracrina antioxidante y antinflamatoria (conocido como secretoma) para combatir cambios dañinos en su entorno. La actividad antioxidante y antinflamatoria del secretoma de las hMSC es potenciada al estimular previamente estas células con moléculas pro-inflamatorias. De esta forma, se ha reportado que el tratamiento con secretoma de hMSC precondicionadas, disminuye el estrés oxidativo y la neuroinflamación en modelos animales de adicción al alcohol y a la nicotina, reduciendo su consumo voluntario, pero su uso como tratamiento en un modelo de adicción a opioides aún no ha sido evaluado. Este estudio apunta a la generación de un modelo in vitro de microglías y astrocitos de rata, que genere estrés oxidativo e inflamación por exposición a opioides. De esta manera, se pretende evaluar la siguiente hipótesis “El tratamiento con secretoma derivado de hMSC precondicionadas, reduce los niveles de citoquinas pro-inflamatorias y marcadores de estrés oxidativo, en un modelo in vitro de exposición a opioides”. La cual fue abordada usando una línea celular inmortalizada de astrocitos de rata y cultivos primarios de microglías de rata. Se evaluaron los niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS) y los niveles de mRNA de citoquinas pro-inflamatorias, luego de la incubación de estas células con opioides. Se logró generar un modelo de cultivos primarios de microglías, en donde el tratamiento con morfina generó un aumento de mRNAs que codifican para citoquinas pro-inflamatorias (específicamente IL-6), pero un efecto antioxidante en las mediciones de ROS. Por otro lado, el tratamiento con fentanilo generó un aumento tanto de ROS como de los mRNA de las citoquinas pro-inflamatorias IL-6, IL-1 y TNF-α, efectos que fueron prevenidos con el pretratamiento de estas células con secretoma de hMSC. En conclusión, este estudio logró demostrar un efecto benéfico del tratamiento de microglías con secretoma de hMSC, frente a la acción detrimental del fentanilo, en términos de generación de ROS y aumento de los niveles de citoquinas pro-inflamatorias. Los resultados obtenidos aportan nueva evidencia sobre los posibles mecanismos mediante los cuales los opioides aumentan el estrés oxidativo e inflamación, eventos claves para el desarrollo, establecimiento y mantención de la adicción a opioides y sugieren una nueva alternativa terapéutica para el tratamiento de esta devastadora patología

Uncontrolled opioid use has become a serious global health problem due to the physical dependence that they generate. The rates of addiction, relapse and deaths due to overdose have increased sharply in recent years, mainly associated with the use of morphine and fentanyl. The generation of oxidative stress and neuroinflammation in the brain's reward system, caused by the repeated use of these drugs of abuse, has been strongly related to the development and maintenance of addictive behaviors. Oxidative stress and neuroinflammation reduce the activity of glutamate transporters (the main excitatory neurotransmitter in the brain) present in microglia and astrocytes. This event prevents the normal regulation of glutamate levels in the reward system, which leads to its pathological overactivation, promoting behaviors that favor drug use and relapse. Therefore, new experimental approaches are needed that seek to reverse this increase in oxidative stress and neuroinflammation in microglia and astrocytes, and consequently reduce the risk of developing opioid addiction. As a possible treatment, we propose a therapy based on the powerful antioxidant and anti-inflammatory capacity of human mesenchymal stem cells (hMSC). These cells secrete a broad array of molecules with paracrine antioxidant and anti-inflammatory activity (known as secretome) to combat harmful changes in their environment. The antioxidant and anti-inflammatory activity of the hMSC secretome is enhanced by the previous stimulation of these cells with pro-inflammatory molecules. In this way, it has been reported that the treatment with secretome derived from preconditioned hMSC decreases oxidative stress and neuroinflammation in animal models of addiction to alcohol and nicotine, reducing their voluntary intake, but its use as a treatment in an opioid addiction model has not yet been evaluated. This study aims to generate an in vitro model of rat microglia and astrocytes, which generates oxidative stress and inflammation due to opioid exposure. In this way, it is intended to study the following hypothesis "Treatment with secretome derived from preconditioned hMSC reduces the levels of pro-inflammatory cytokines and oxidative stress markers, in an in vitro model of opioid exposure". Which was approached using an immortalized rat astrocyte cell line and primary cultures of rat microglia. Intracellular ROS levels and pro-inflammatory cytokine mRNA levels were evaluated after incubation with opioids. It was possible to generate a model of primary microglia, where morphine treatment generated an increase in inflammatory mRNAs (specifically IL-6), but it proved to have an antioxidant effect in ROS measurements. On the other hand, fentanyl treatment generated an increase in both ROS levels and IL-6, IL-1 and TNF-𝛼 levels, effects that were prevented by the pretreatment of these cells with the hMSC secretome. In conclusion, this study was able to demonstrate a beneficial effect of hMSC secretome treatment in microglia, against the detrimental action of fentanyl, in terms of ROS generation and increased levels of pro-inflammatory cytokines. The obtained results provide new evidence on the possible mechanisms by which opioids increase oxidative stress and inflammation, key events for the development, establishment and maintenance of opioid addiction and suggest a new therapeutic alternative for the treatment of this devastating pathology