Caracterización y funcionalidad del gen CYP51 de Xanthophyllomyces dendrorhous involucrado en la biosíntesis de ergosterol

Abstract

X. dendrorhous es una levadura basidiomycete que sintetiza astaxantina, un carotenoide de gran interés biotecnológico. Actualmente, estudios de regulación de la vía carotenogénica en este microorganismo demostraron que los esteroles cumplen un rol importante en la carotenogénesis. Cabe destacar que las vías de síntesis de carotenoides y esteroles se encuentran relacionadas, pues ambas derivan de la vía del mevalonato y en ellas participan enzimas citocromo P450s (CYPs). Las CYPs comprenden una superfamilia de proteínas, donde destaca la familia CYP51 con actividad C14-desmetilasa de esteroles. El objetivo del trabajo fue caracterizar y estudiar la funcionalidad del gen CYP51 de X.dendrorhous involucrado en la biosíntesis de ergosterol. Mediante análisis bioinformático del genoma y transcriptoma de la levadura, se identificó un posible gen CYP51, cuya funcionalidad se estudió por complementación heteróloga en una cepa de S. cerevisiae mutante para dicho gen. Se realizó un análisis fenotípico de la cepa transformante hCYP51 mediante construcción de curvas de crecimiento y análisis de producción de esteroles. Cabe destacar que la complementación de la actividad C14-desmetilasa en la cepa mutante de S. cerevisiae, permitiendo su sobrevida y la biosíntesis de ergosterol confirma la participación del gen CYP51 de X. dendrorhous en la vía de síntesis de ergosterol. Además, se evaluó el impacto de la eliminación de un alelo del gen CYP51 de X. dendrorhous en cuanto a producción de carotenoides y esteroles. Los resultados revelaron una disminución de un 36% del contenido de esteroles, principalmente ergosterol, y un aumento de 30% del contenido de carotenoides respecto a la cepa silvestre de X. dendrorhous después de 24 y 120 h de cultivo, respectivamente. Además, se analizó el cambio en los patrones de expresión de los genes HMGR, crtR y CYP51 en la cepa mutante heterocigota CYP51+/- respecto a la cepa silvestre, esto mostró que la escición de uno de los alelos del gen CYP51 provoca una disminuación en el nivel de expresión de dicho gen y está asociada a un aumento de los niveles de expresión de los genes HMGR y crtR, que codifican enzimas involucradas en la vía del mevalonato y en la vía de síntesis de carotenoides o esteroles, respectivamente. De esta manera, debido a que la expresión del gen CYP51 de X. dendrorhous complementa la deficiencia de la enzima 14 a-desmetilasa de esteroles en S. cerevisiae permitiendo su sobrevida y la biosíntesis de ergosterol; su mutación en X. dendrorhous altera la producción de esteroles y de carotenoides junto con la modificación de los patrones de expresión de genes en ambas vías, se concluye que efectivamente el gen CYP51 de X. dendrorhous corresponde a un 14 a-desmetilasa de esteroles que participa en la biosíntesis de ergosterol.

Xanthophyllomyces dendrorhous is a basidiomycete yeast that synthesizes astaxanthin, which is a carotenoid of great biotechnological interest. Currently, studies regarding the regulation of the carotenogenic pathway in this organism showed that sterols play an important regulatory role in carotenogenesis. It is noteworthy that the carotenoid and sterols synthesis pathways are related because both derived from the mevalonate pathway and in both pathways, cytochrome P450 enzymes (CYPs) are involved. The CYPs comprise a superfamily of proteins and among them, the CYP51 family that has sterol C14-demethylase activity is one of the most remarkables. The objective of this work was to characterize and study the functionality of the CYP51 gene of X. dendrorhous, which is involved in ergosterol biosynthesis. By bioinformatic analyses of the genome and the transcriptome of yeast, а putative CYP51 gene was identified and its functionality was studied by heterologous complementation in S. cerevisiae using a mutant strain. Phenotypic analyses of the hCYP51 transformant strain were performed by the construction of growth curves and the analysis of sterol production. It is noteworthy that the expression of CYP51 gene complements the deficiency of the 14 a-demethylase enzyme in S. cerevisiae allowing its survival and ergosteroi biosynthesis, and therefore it can be stated that the CYP51 gene of X. dendrorhous is involved in ergosterol biosynthesis. Furthermore, the impact of the disruption of one allele of the CYP51 gene in X. dendrorhous regarding the production of carotenoids and sterols was evaluated. The results showed a decrease of 36% of the sterol content (principally ergosterol) and an increase of 30% of the carotenoid content compared to the wild type X. dendrorhous strain after 24 and 120 h of culture, respectively. In adittion, the fold change in the expression of HMGR, crtR y CYP51 genes between the mutant strain compared to the wild-type one, showed that indeed the disruption of one allele of the CYP51 gene of X. dendrorhous cause a reduction in the levels of its transcript, which was associated with increased expression of the HMGR and crtR genes that encode enzymes involved in the mevalonate pathway and the carotenoid and sterol synthesis pathways, respectively. In conclusion, because the expression of CYP51 gene complements the deficiency of the sterol 14 a-demethylase enzyme in S. cerevisiae allowing its survival and ergosterol biosynthesis, and that the CYP51 mutation in X. dendrorhous alters the production of sterols and carotenoids, and modifies the expression patterns of genes in both pathways (HMGR, crtR and CYP51), it can be stated that the CYP51 gene of X. dendrorhous is involved in ergosterol biosynthesis.