La sobreproducción de los genes de la maduración de la microcina E492 aumenta la actividad bactericida y retarda la formación de agregados de tipo amiloide

Abstract

La microcina E492 es un péptido antibiótico de 7,9 kDa producido por Klebsiella pneumoniae RYC492 que mediante la formación de canales iónicos produce la despolarización de la membrana citoplasmática de las bacterias sensibles a esta bacteriocina. Esta microcina presenta la particularidad de ser producida en forma activa sólo durante la fase exponencial de crecimiento bacteriano, a diferencia de otras microcinas descritas, que son producidas principalmente durante la fase estacionaria. El decaimiento de la actividad bactericida en fase estacionaria de crecimiento se correlaciona con la aparición de agregados de tipo amiloide y con la disminución en la tasa de transcripción de los genes mceJl, cuyos productos génicos están involucrados en el proceso de maduración de la microcina. En esta tesis se abordó el estudio de la relación entre la expresión de los genes mceJl, la producción de microcina E492 activa y la formación de agregados amiloides. Se demostró que un aumento en la dosis génica de los genes de la maduración conduce a un aumento en la actividad bactericida y a un retardo en la pérdida de actividad en fase estacionaria de crecimiento. En cambio, el aumento en la dosis génica de los genes mceAB (gen estructural y de la inmunidad) produce una disminución en la actividad bactericida de la microcina y un aumento en la agregación. Se estableció que la agregación in vitro de la microcina depende inversamente de la capacidad de producir microcina activa de la cepa productora. Los agregados formados se caracterizaron bioquímica, electrofisiológica y microscópicamente, determinándose que estos agregados no presentan actividad bactericida sobre esferoplastos, no forman canales iónicos en bicapas lipídicas y forman filamentos de tipo amiloide. Los resultados de esta tesis sugieren que no sólo la secuencia aminoacídica de la microcina afecta su capacidad de agregarse, sino que también su estado de maduración. En conclusión, la capacidad de la bacteria de producir dos formas de microcina permite modular la agregación de esta proteína y de esta manera controlar su actividad bactericida.

Microcin E492 is an antibiotic peptide of 7.9 kDa produced by Klebsiella pneumoniae RYC492 that induces, by forming ion channels, depolarization of the cytoplasmic membrane on sensitive cells. This microcin presents the particularity of being produced in an active form only during the exponential phase of bacterial growth, unlike others that are produced mainly during the stationary phase. The decay of the bactericidal activity stationary phase of growth is correlated with a diminution in the rate of transcription of the genes mceJl, whose genic products are involved in the maturation process of the microcin, and also in the appearance of amyloid-like in aggregates. The relationship between the expression of the genes mceJl, the production of active microcin E492 and the amyloid aggregates formation was studied in this thesis. It was demonstrated that an increase in the genetic dose of the maturation genes leads to an increase on the bactericidal activity and a delay in the loss of activity in the stationary phase. On the other hand the increase in the genetic dose of mceAB genes (microcin and the immunity genes) produces a diminution in the bactericidal activity of microcin and an increase in the aggregation. It was established in vitro that the aggregation of the microcin inversely depends on the capacity to produce active microcin of the producing strain. The aggregates were characterized biochemically, electrophysiologically and microscopically. It was determined that these aggregates do not present bactericidal activity on spheroplasts, do not form ion channels in lipidic bilayers and form amyloid-like fibrils. The results of this thesis suggest that not only the amino acid sequence of microcin affects the capacity of aggregation, but also the maturation state. In conclusion, the capacity of the bacteria to produce two forms of microcin allows aggregation modulation and in this way to control the bactericidal activity.