Estrategia de mutagénesis sitio dirigida para la búsqueda de una endoxilanasa con alta actividad catalítica a temperaturas moderadas

Abstract

Los desechos de biomasa lignocelulósica tienen gran potencial para ser reutilizados. El xilano, componente de este desecho orgánico, puede ser degradado por medios enzimáticos para obtener varios productos, entre ellos, xilooligosacáridos (XOS), que poseen propiedades prebióticas. Los prebióticos son beneficiosos para la salud digestiva de los humanos. Esta memoria se centró en la mutagénesis de una enzima xilanasa de la familia GH10 llamada extraída del hongo Gloephyllum trabeum, llamada GtXyn10A. Esta enzima hidroliza el sustrato xilano en XOS, y el objetivo de la mutación es aumentar su actividad catalítica a temperaturas moderadas (30-40°C). Utilizando herramientas bioinformáticas se predijo la estructura tridimensional de GtXyn10A con lo que se pudo identificar el residuo glutamina 124 (Q124) como posible blanco para mejorar la actividad enzimática. Utilizando técnicas de biología molecular se hizo una mutación puntual sustituyendo Q124 por ácido glutámico (E), para luego probar la actividad de la enzima xilanasa mutada a distintas temperaturas entre 30-90°C. La mutación se realizó por medio de mutagénesis Overlap PCR. Para amplificar el gen, éste fue subclonado en pGemT-easy y transformado en células de Escerichia coli cepa DH5a. Posteriormente, para la expresión recombinante de la xilanasa mutada, se utilizó el vector de expresión pET22b(+) y se transformó en células E. coli BL21(DE3). La expresión recombinante del gen silvestre se logró exitosamente, detectándose una banda de 37kDa que corresponde a GtXyn10A con una actividad xilanasa específica de 357,4 U en el medio de cultivo. Se expresó la enzima silvestre y mutada on Q124E en ambas en BL21(D23) y se les aplicó precipitación con sulfato de amonio, diálisis y cromatografía líquida. Al comparar la actividad enzimática de ambas luego de la cromatografía, se observa un aumento de un 15% en actividad específica de la enzima mutante contra la silvestre, con estadísticas favorables a un aumento de valor. Sin embargo, el nivel de purificación o separación de las proteínas no es apto para una caracterización de la actividad y la comparación específica de actividades se debe hacer luego de una purificación adecuada para cada proteína. El trabajo concluye que la enzima mutante posee una actividad específica similar a la silvestre, y tiene potencial para poder alcanzar mayor actividad enzimática con xilano a temperaturas moderadas.