Generación de líneas celulares estables knock-out para PRPK mediante CRISPR/CAS9

Abstract

This work describes the creation and characterization of human neuroblastoma SH-SY5Y lines knock-out for PRPK (P53 Related Protein Kinase), a poorly characterized kinase with a role related to the regulation of axon elongation in early stages of neuronal development. The PRPK gene was disrupted by the insertion of selection markers into the coding region of the first PRPK exon using CRISPR methodology, thereby preventing protein expression. Although complete knock-out was not achieved, multiple lines with stable PRPK reduction were generated and validated by western-blot and genotyping. These cell lines exhibited a marked negative effect on cell proliferation, a positive effect on retinoic acid-induced cell differentiation, and alterations in the expression of Rabs proteins, which are associated with vesicle trafficking and neurite elongation. The effect on proliferation and possible lethality on complete knockouts may suggest the essentiality of PRPK in neuroblastomas, as supported by observations in model organisms and other cell lines. The effect on Rabs expression was similarly observed in a complete KO line in HEK293, consistently with that observed in SH-SY5Y, indicating a conserved role. In conclusion, the knock-out of PRPK in SH-SY5Y cell lines had significant effects on cell proliferation and differentiation, as well as on the expression of Rabs proteins involved in vesicle trafficking and neurite elongation. These results suggest that PRPK plays a critical role in vesicle trafficking during cell development, and further research is warranted to investigate the potential clinical implications of these findings.

Este trabajo describe la creación y caracterización de líneas de neuroblastoma humano SH-SY5Y knock-out para PRPK (P53 Related Protein Kinase), una kinasa poco caracterizada con un papel relacionado con la regulación de la elongación del axón en etapas tempranas del desarrollo neuronal. El gen PRPK se interrumpió mediante la inserción de marcadores de selección en la región codificante del primer exón PRPK utilizando la metodología CRISPR, lo que impidió la expresión de la proteína. Aunque no se logró la eliminación completa, se generaron múltiples líneas con reducción estable de PRPK, las cuales fueron validadas mediante Western-blot y genotipificación. Estas líneas celulares exhibieron un marcado efecto negativo sobre la proliferación celular, un efecto positivo sobre la diferenciación celular inducida por ácido retinoico, y alteraciones en la expresión de proteínas Rabs, las cuales están asociadas con el tráfico de vesículas y la elongación de neuritas. El efecto sobre la proliferación y posible letalidad en las inactivaciones completas sugieren la esencialidad de la PRPK en neuroblastomas, respaldado por observaciones en organismos modelo y otras líneas celulares. El efecto sobre la expresión de Rabs se observó de manera similar en una línea KO completa en HEK293, de manera consistente con lo observado en SH-SY5Y, indicando un rol conservado. En conclusión, la eliminación de PRPK en las líneas celulares SH-SY5Y tuvo efectos significativos en la proliferación y diferenciación celular, así como en la expresión de proteínas Rabs involucradas en el tráfico de vesículas y la elongación de neuritas. Estos resultados sugieren que la PRPK desempeña un papel fundamental en el tráfico de vesículas durante el desarrollo celular, y justifican una mayor investigación para investigar las posibles implicaciones clínicas de estos hallazgos.