Desarrollo de técnica de homogeneización para cultivo de microorganismos a partir de tejido pulmonar

Abstract

Durante décadas se creyó que los pulmones eran órganos estériles a pesar de que esto siempre careció de fundamentos. Actualmente se sabe que no es así gracias al desarrollo de técnicas de biología molecular las cuales han permitido evidenciar una estrecha relación entre la microbiota en las áreas respiratorias inferiores y la homeostasis del hospedero. Sin embargo, estas técnicas están basadas en la secuenciación de ADN microbiano, lo que puede corresponder a microorganismos vivos, pero también muertos. Para llevar a cabo el cultivo de microorganismos a partir de tejidos de pulmón es necesario homogeneizar previamente el tejido para liberar los microorganismos adheridos, mientras se debe mantener la integridad de los microorganismos presentes y también limitar los riesgos de contaminación. Dentro de las técnicas de homogeneización de tejidos, se eligió evaluar la técnica por “bead-beating” o ruptura con microesferas, que consiste en el contacto mecánico del tejido con microesferas provocando así la ruptura de la membrana celular y la separación de los microbios que la habitan. El objetivo general del presente Seminario de Título es la evaluación de una técnica de homogeneización del tejido de pulmón que permita a posteriori el cultivo de los microorganismos que componen la microbiota pulmonar. Para ello se evaluó el efecto de la técnica de homogeneización por “bead-beating” en cultivos líquidos de Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Candida albicans para determinar cuáles parámetros afectan en menor medida su sobrevivencia. Luego se evaluaron los parámetros escogidos sobre una muestra de pulmón de ratones, el cual fue inoculado con un “pool” conformado por los mismos microorganismos. Por último, la técnica de homogeneización por “bead-beating” fue aplicada para la caracterización de la microbiota pulmonar de ratones usando métodos de cultivo. Los parámetros más efectivos para la recuperación de los microorganismos analizados en cultivo líquido fueron la homogeneización por “bead-beating” durante 1 minuto con microesferas de 2,3 mm de diámetro. Luego de aplicar la técnica sobre el tejido pulmonar, se logró recuperar el 70% del “pool” de microorganismos inoculado artificialmente en el modelo animal. Por último, tras aplicar la técnica de homogeneización desarrollada, se logró recuperar y cultivar las especies bacterianas dominantes de la microbiota pulmonar del modelo animal. Este trabajo contribuye en proveer una técnica efectiva para el cultivo de microorganismos que constituyen la mayor proporción de la microbiota pulmonar en ratones como así también podría utilizarse en otros estudios para comprender los mecanismos de interacción entre microorganismo-huésped de las bacterias más abundantes en el pulmón, las cuales son claves para poder desarrollar blancos terapéuticos contra enfermedades pulmonares. Sería necesario optimizar los métodos de cultivo desarrollado en este trabajo para una mejor caracterización de la microbiota pulmonar.

For decades it was believed that the lungs were sterile organs despite the fact that this claim has always been unfounded. It is currently known that this is not true thanks to the development of molecular biology techniques which have revealed a close relationship between the microbiota in the lower respiratory areas and host homeostasis. However, these techniques are based on microbial DNA sequencing, which can correspond to living microorganisms, but also dead ones. To carry out the culture of microorganisms from lung tissues, it is necessary to previously homogenize the tissue in order to release the adhered microorganisms, while maintaining the integrity of the microorganisms present and also limiting the risks of contamination. Within the tissue homogenization techniques, it was chosen to evaluate the technique by "bead-beating" or rupture with microspheres, which consists on the mechanical contact of the tissue with beats, thus causing the rupture of the cell membrane and separation of the microbes that they inhabit it. The principal objective of this work is the evaluation of a lung tissue homogenization technique that allows a posteriori cultivation of the microorganisms that are part of the lung microbiota. First, the effect of the bead-beating homogenization technique was evaluated in liquid cultures of Escherichia coli, Staphylococcus aureus and Candida albicans to determine which parameters affect their survival to a lesser extent. The chosen parameters were then evaluated on a mouse lung sample, which was inoculated with a pool made up of the same microorganisms. Finally, the bead-beating homogenization technique was applied for the characterization of the lung microbiota of mice using culture methods. The most effective parameters for the recovery of the microorganisms analyzed in liquid culture were the homogenization by bead-beating for 1 minute with 2.3 mm beats. After applying the technique on the lung tissue, it was possible to recover 70% of the pool of microorganisms artificially inoculated in the animal model. Finally, after applying the homogenization technique developed, it was possible to recover and cultivate the dominant bacterial species of the lung microbiota of the animal model. Finally, this work contributes to providing an effective technique for the cultivation of microorganisms that constitute the largest proportion of the lung microbiota in mice and could be used in studies to understand the mechanisms of interaction between microorganisms and hosts of the most abundant bacteria in the lung. which are key to developing therapeutic targets against lung diseases. However, it is necessary to optimize the culture methods for a better characterization of the lung microbiota.