Obtención y análisis de tomates transformados estable y transitoriamente con el gen que codifica para sorbitol deshidrogenasa (SDH) obtenido de malus x domestica y clonación de dos SDH en el vector PCP

Abstract

La sorbitol deshidrogenasa (SDH) es la principal enzima involucrada en el metabolismo del sorbitol en especies de la familia de las rosáceas, tales como manzanos o duraznos. Durante la maduración de los frutos, SDH cataliza la oxidación de sorbitol a fructosa, azúcar que posee una mayor sensacion de dulzor que el sorbitol. Par lo tanto, SDH juega un papel importante en el aumento de la dulzura natural de la fruta durante el desarrollo. Esto hace a la SDH una candidata excelente para modular la composición de azucares en el fruto, dado que el aumento de su expresión especifica en este órgano provocaría la oxidacion del sorbitol remanente, que no ha sido metabolizado durante el proceso de maduracion. Con el fin de generar una nueva van.edad de manzanas con frutos mas diilce§, se utilizaron vectores binarios en los que una SDH de manzana (MdsoH) se encuentra bajo el control de dos promotores diferentes, lino constitutivo (35S) y el otro fruto-especifico (PG). En primer lugar, para comprobar su funcionalidad, se utilizaron plantas de tomate como sistema modelo, las cuales se transformaron establemente con Agrobacterium tumefaciens, que portaba los vectores nombrados anteriormente. Se eljgio esta especie como sistema modelo ya que es de crecimiento rapido y genera frutos tempranamente, en comparacion con el manzano. De esta manera se pudo evaluar la funcionalidad de los vectores en el corto plazo, al contraste de haberlo realizado inmediatamente en el manzano, el cual se demora entre 4-5 afros en dar frutos. Luego de que las plantas de tomate se transformaran, se seleccionaron en medios suplementados con higrometría. De las plantas resistentes se hicieron extracciones de ADN gen6mico y posteriormente anali§is de PCR. Estos determinaron que las plantas seleccionadas efectivamente poselan MdsDH insertado en el genoma. En segundo lugar, ensayos de actividad enzimática SDH mostraron que los frutos de plantas transformadas establemente (transgénicas) con el vector 35S-MdsDH, presentan una mayor actividad SDH en comparacion con su control 35S-GFP. Lo mismo ocurre con los frutos transformados transitoriamente con 35- MdsDH o PG-MdsDH, los cuales poseen mayor actividad SDH que los frutos transformados con los vectores controles (35S-GFP a PG-GFP, respectivamente). Por ultimo, se clonaron las SDH de manzana (MdsDm y de tomate (Lesofty, bajo los promotores 35S y PG en otro vector binan.o llamado PCP, el cual presenta resistencia al herbicida BASTA y no a un antibi6tico de selecci6n bacteriano (kanamicina). Los vectores generados, PCP-35S-MdsDH-NOS. PCP-35S-LesDH-NOS y Pop-PG-MdsDH-NOS, que otorgan resistencia a la herbicida BASTA, pueden ser utilizados en trabajos futuro