Desarrollo de un protocolo de sobreexpresión y purificación, y una metodología enzimática a gran escala (high-throughput) para medir la actividad de la proteína Polifosfato quinasa 1, (PPK1) de Escherichia coli

Abstract

Los polifosfatos inorgánicos son polímeros altamente ubicuos, presentes en todos los dominios de la vida. Estas moléculas pueden contener desde diez hasta cientos de residuos de ortofosfato unidos por enlaces fosfo-anhidro de alta energía, lo que los hace muy buena fuente de energía alternativa al ATP, ademas de ser reservorios de fosfato inorgánico, quelantes de cationes metálicos, etc. Los niveles de 6ste polímero en la c6lula están relacionados con el estado metab6lico y fisiol6gico de la célula, asociados al estado estacionario de la curva de crecimiento bacteriana, y a situaciones de estr6s, donde se encuentran los niveles mas elevados dentro de la célula. Los polifosfatos también han sido relacionados con procesos celulares asociados a la patogénesis bacteriana. Mutantes de la enzima PPKl resultan ser viables, pero con fenotipos visiblemente atenuados en relaci6n a la virulencia, patog6nesis y resistencia a antibi6ticos en microorganismos enteropatogenos como Pseudomonas aeruginosa, Salmonella tiphimurium, Klebsiella aerogenes entre otros. Dadas estas características, es que la PPKl se ha propuesto como un blanco prometedor para el diseño de nuevos compuestos antimicrobianos que no afecten la viabilidad bacteriana, sino que ataquen las funciones asociadas a la produccion de factores de virulencia, resultando ser una alternativa antivirulencia, en contraposici6n al efecto bactericida logrado por los antibi6ticos de uso comun. Para el desarrollo de una terapia con un compuesto inhibidor de la PPKl resulta necesario, en primera instancia, desarrollar una metodología de facil imp[ementaci6n y aplicable a gran esca[a, que permita llevar a cabo estudios in vitro de la actividad enzimática de la PPKl y que brinde la capacidad de obtener parámetros cinéticos que permitan cuantificar la actividad inhibitoria de dichos compuestos. En este trabajo se clon6 y purific6 la PPKl de E. coll a partir de la fracci6n soluble y se desarrollo una metodología para el estudio de la actividad enzimática de la enzima PPKl de E. colli, aprovechando su condici6n de bacteria modelo del grupo de las gram negativas, ademas del alto grado de conservaci6n de dicha enzima dentro del grupo de las bacterias enteropat6genas. Para lograr esto fue preciso sobre expresar la proteína, a partir del clonamiento del gen ppk7 de E. oo//.fusionado a una secuencia codificante para un Tag de 6 residuos de histidina (His6), [o que permiti6 realizar la purificaci6n en un solo paso mediante cromatografía por afinidad. Luego de obtener la proteína purificada en su forma activa, se desarroll6 un protocolo para realizar los ensayos de cuantificaci6n de los polip de forma eficiente y a gran escala mediante un ensayo fluorimetrico en placas multipocillos con DApl. EI desarrollo de esta metodología permiti6 determinar algunos parámetros cineticos y realizar un ensayo de la actividad inhibitoria de 40 mol6culas diseñadas previamente a trav6s de un estudio de dock/.ng molecular in silico