Proteína VCAM-1 en la sobrevida del cardiomiocito precondicionado con TNF-α frente el daño por isquemia/reperfusión

Abstract

Antecedentes: Las enfermedades cardiovasculares (ECV) son la principal causa de mortalidad en Chile y el mundo, a expensas principalmente de las enfermedades isquémicas del corazón. Diferentes mediadores proinflamatorios, como el factor de necrosis tumoral-alfa (TNF-α) y la proteína de adhesión celular vascular-1 (VCAM-1), desempeñan un papel clave en el desarrollo y complicaciones de las ECV. Se ha descrito que TNF-α causa muerte celular por apoptosis en diferentes tipos celulares. Sin embargo, paradójicamente esta citoquina a bajas concentraciones genera precondicionamiento y cardioprotección frente el daño por hipoxia o isquemia/reperfusión. Se ha propuesto que esta acción disímil podría ser mediada por diferentes receptores, el receptor 2 de TNF-α (TNFR2) se asocia a sobrevida celular y tiene un papel cardioprotector en los efectos del precondicionamiento cardíaco. Por otro lado, VCAM-1 se expresa en diversos tejidos y tipos celulares, su función se ha estudiado principalmente en el endotelio vascular. VCAM-1 está involucrada en la transmigración leucocitaria, diferenciación muscular, proliferación celular y en el desarrollo del corazón. La expresión de VCAM-1 se puede inducir por citoquinas proinflamatorias, altos niveles de especies reactivas del oxígeno y lipoproteínas de baja densidad oxidadas, entre otros. Dicha inducción es canónicamente mediada por el factor transcripcional NF-κB. Sin embargo, la función y los mecanismos de regulación de VCAM-1 en el cardiomiocito se conocen escasamente. Estudios previos de nuestro Laboratorio mostraron que VCAM-1 se asocia a sobrevida en un modelo de isquemia simulada en cardiomiocitos. Hipótesis de trabajo: “TNF-α, a bajas concentraciones y a través de la vía de señalización TNFR2/JAK2/STAT3, estimula la expresión de VCAM-1 en el cardiomiocito como mecanismo de protección frente el daño por isquemia/reperfusión simulada”. Objetivos específicos: 1) Determinar el efecto de TNF-α sobre la expresión de la proteína y mRNA de VCAM-1 en los cardiomiocitos; 2) Evaluar si la expresión de VCAM-1 estimulada por TNF-α depende del receptor TNFR2 y la vía de señalización JAK2/STAT3 en los cardiomiocitos; 3) Examinar si la proteína VCAM-1 media el efecto protector frente el daño por isquemia/reperfusión simulada en cardiomiocitos precondicionados con TNF-α. Diseño experimental y metodologías: Todos los experimentos se realizaron en cultivos primarios de cardiomiocitos de rata neonata estimulados con TNF-α recombinante de rata. Se evaluó viabilidad celular por ensayo de reducción de MTT, incorporación de azul de tripán y niveles intracelulares de ATP. Se midieron niveles relativos de mRNA de VCAM-1, TNFR1, TNFR2, TNF-α, IL-6, Nfr2, SOD2, HO-1 y CAT por RT-qPCR. Los niveles de proteínas totales y fosforiladas de VCAM-1, NF-kB, STAT3, Akt y ERK1/2 se determinaron por Western blot. La biosíntesis de novo de VCAM-1 se evaluó mediante la inhibición farmacológica de la transcripción y la traducción. La estabilidad del mRNA de VCAM-1 se determinó midiendo el mRNA remanente después del tratamiento con actinomicina-D. El papel de los receptores TNFR1/TNFR2 en la expresión de VCAM-1 se evaluó mediante el silenciamiento de estos receptores con siRNA y la medición de los niveles de mRNA por RT-qPCR. El papel de la vía JAK2/STAT3 en la expresión de VCAM-1 se evaluó utilizando inhibidores farmacológicos de la vía y la medición de los niveles proteicos totales y fosforilados de VCAM-1 y STAT3 por Western blot. El efecto cardioprotector del precondicionamiento con TNF-α se evaluó con un ensayo de isquemia/reperfusión (I/R) simulada. Se evaluó muerte por necrosis por ensayo de actividad de LDH. El papel de VCAM-1 en la cardioprotección inducida por TNF-α se evaluó mediante el silenciamiento con siRNA previo al ensayo de isquemia/reperfusión simulada. El efecto del silenciamiento de VCAM-1 en la expresión de genes asociados a sobrevida celular y cardioprotección se evaluó midiendo niveles de mRNA de estos genes por RT-qPCR. Resultados: El tratamiento con TNF-α a concentraciones < 100 ng/mL no estimula muerte significativa de los cardiomiocitos. TNF-α a concentraciones entre 10 – 100 ng/ mL aumenta los niveles proteicos de VCAM-1 después de 6 h de tratamiento. De igual manera, TNF-α aumenta los niveles de mRNA de VCAM-1 en los cardiomiocitos. La inhibición de la transcripción y la traducción reducen los niveles proteicos de VCAM-1 y TNF-α no altera la estabilidad del mRNA de VCAM-1, lo que sugiere que TNF-α aumenta la expresión de VCAM-1 a través de un mecanismo transcripcional. Por otro lado, TNF-α estimula la activación de NF-kB, STAT3, Akt y ERK1/2, vías de señalización asociadas con sobrevida y cardioprotección. Nuestros datos sugieren que la expresión de VCAM-1 es dependiente del receptor TNFR1 y no del TNFR2. Además, nuestros datos sugieren que la vía JAK2/STAT3 participa en la expresión de VCAM-1 en el cardiomiocito. Finalmente, el tratamiento con TNF-α a concentraciones de 10 ng/mL por al menos 6 h provee protección a los cardiomiocitos frente el daño por I/R. La proteína VCAM-1 media el efecto protector del precondicionamiento con TNF-α frente el daño por I/R en los cardiomiocitos. Nuestros resultados muestran que el silenciamiento de VCAM-1 en los cardiomiocitos reduce la expresión de TNF-α, IL-6 y SOD2, genes asociados a sobrevida y cardioprotección frente estrés oxidativo. Lo que sugiere que VCAM-1 podría ser un regulador positivo de SOD2 y de esta forma activar la respuesta antioxidante como mecanismo de cardioprotección frente el daño por I/R. Conclusiones: Se rechazó la hipótesis planteada en este estudio y se concluye que TNF-α a concentraciones de 10 ng/mL estimula la expresión de VCAM-1 en el cardiomiocito como mecanismo protector frente el daño por isquemia/reperfusión, a través de la vía de señalización TNFR1/JAK2/STAT3. Sin embargo, nuestros datos no son suficientes para concluir si VCAM-1 activa la respuesta antioxidante como mecanismo de cardioprotección frente el daño por isquemia/reperfusión.

Background: Cardiovascular diseases (CVD) are the main cause of mortality in Chile and worldwide, mainly at the expense of ischemic heart diseases. Different proinflammatory mediators, such as tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) and vascular cell adhesion protein-1 (VCAM-1), play a key role in the development and complications of CVD. TNF-α has been reported to cause cell death by apoptosis in different cell types. However, paradoxically, this cytokine at low concentrations generates preconditioning and cardioprotection against damage by hypoxia or ischemia/reperfusion. It has been proposed that this dissimilar action could be mediated by different receptors. TNF-α receptor 2 (TNFR2) is associated with cell survival and has a cardioprotective role in the effects of cardiac preconditioning. On the other hand, VCAM-1 is expressed in various tissues and cell types, its function has been studied mainly in the vascular endothelium. VCAM-1 is involved in leukocyte transmigration, muscle differentiation, cell proliferation, and heart development. VCAM-1 expression can be induced by proinflammatory cytokines, high levels of reactive oxygen species, and oxidized low-density lipoproteins, among others. This induction is canonically mediated by the transcriptional factor NF-κB. However, the function and regulatory mechanisms of VCAM-1 in the cardiomyocyte are poorly understood. Previous studies from our Laboratory showed that VCAM-1 is associated with survival in a model of simulated ischemia in cardiomyocytes. Hypothesis: "TNF-α, at low concentrations and through the TNFR2/JAK2/STAT3 signaling pathway, stimulates the expression of cardiomyocyte VCAM-1as a protective mechanism against damage by ischemia/ simulated reperfusion”. Specific aims: 1) To determine the effect of TNF-α on the expression of the protein and mRNA of VCAM-1 in cardiomyocytes; 2) To assess whether the expression of VCAM-1 stimulated by TNF-α depends on the TNFR2 receptor and the JAK2/STAT3 signaling pathway in cardiomyocytes; 3) To examine whether the VCAM-1 protein mediates the protective effect against simulated ischemia/reperfusion damage in cardiomyocytes preconditioned with TNF-α. Experimental design and methodologies: All experiments were performed on primary cultures of neonatal rat cardiomyocytes stimulated with recombinant rat TNF-α. Cell viability was evaluated by MTT reduction assay, trypan blue incorporation and intracellular ATP levels. Relative mRNA levels of VCAM-1, TNFR1, TNFR2, TNF-α, IL-6, Nfr2, SOD2, HO-1, and CAT were measured by RT-qPCR. Total and phosphorylated protein levels of VCAM-1, NF-kB, STAT3, Akt, and ERK1/2 were determined by Western blot. VCAM-1 de novo biosynthesis was assessed by pharmacological inhibition of transcription and translation. The stability of VCAM-1 mRNA was determined by measuring the mRNA remaining after treatment with actinomycin-D. The role of TNFR1/TNFR2 receptors in VCAM-1 expression was assessed by silencing these receptors with siRNA and measuring mRNA levels by RT-qPCR. The role of the JAK2/STAT3 pathway in VCAM-1 expression was assessed using pharmacological inhibitors of the pathway and measurement of total and phosphorylated VCAM-1 and STAT3 protein levels by Western blot. The cardioprotective effect of TNF-α preconditioning was assessed with a in vitro ischemia/reperfusion (I/R) assay. Cell death by necrosis was evaluated by LDH activity assay. The role of VCAM-1 in TNF-α-induced cardioprotection was assessed by siRNA silencing prior to the ischemia/reperfusion assay. The effect of VCAM-1 silencing on the expression of genes associated with cell survival and cardioprotection was evaluated by measuring mRNA levels of these genes by RT-qPCR. Results: Treatment with TNF-α at concentrations <100 ng/mL does not stimulate significant cardiomyocyte death. TNF-α at concentrations between 10 – 100 ng/mL increases VCAM-1 protein levels after 6 h of treatment. Similarly, TNF-α increases VCAM-1 mRNA levels in cardiomyocytes. Inhibition of transcription and translation reduces VCAM-1 protein levels and TNF-α does not alter VCAM-1 mRNA stability, suggesting that TNF-α increases VCAM-1 expression through a mechanism transcriptional. On the other hand, TNF-α stimulates the activation of NF-kB, STAT3, Akt and ERK1/2, signaling pathways associated with survival and cardioprotection. Our data suggest that VCAM-1 expression is dependent on the TNFR1 receptor and not on TNFR2. Furthermore, our data suggest that the JAK2/STAT3 pathway is involved in the expression of VCAM-1 in the cardiomyocyte. Finally, treatment with TNF-α at concentrations of 10 ng/mL for at least 6 h provides protection to cardiomyocytes against I/R damage. The VCAM-1 protein mediates the protective effect of TNF-α preconditioning against I/R damage in cardiomyocytes. Our results show that the silencing of VCAM-1 in cardiomyocytes reduces the expression of TNF-α, IL-6 and SOD2, genes associated with survival and cardioprotection against oxidative stress. This suggests that VCAM-1 could be a positive regulator of SOD2 and thus activate the antioxidant response as a cardioprotective mechanism against I/R damage. Conclusions: The hypothesis proposed in this study was rejected and it is concluded that TNF-α at concentrations of 10 ng/mL stimulates the expression of VCAM-1 in the cardiomyocyte as a protective mechanism against ischemia/reperfusion damage, through the TNFR1/JAK2/STAT3 signaling pathway. However, our data are not sufficient to conclude whether VCAM-1 activates the antioxidant response as a cardioprotective mechanism against ischemia/reperfusion damage.