Estudio de las propiedades funcionales y estructurales de la proteína de estrés térmico BiP (Proteína de Unión a Inmunoglobulina) : un regulador maestro con importante rol terapéutico

Abstract

BiP es una chaperona perteneciente a la familia Hsp70 (Heat shock protein 70) que está involucrada en la regulación de importantes procesos biológicos como la síntesis, plegamiento, translocación y degradación de otras proteínas en el retículo endoplásmico de la célula eucarionte. Esta chaperona tiene dos dominios comunicados entre sí para modular su actividad catalítica; un Dominio de Unión de Nucleótidos (NBD), en el extremo N-terminal, que interacciona con nucleótidos, por ejemplo, hidrolizando ATP y uniendo ADP, y el Dominio de Unión de Sustrato (SBD), en el extremo C-terminal, que une proteínas desplegadas. En estudios previos se ha demostrado que una proteína de la misma familia, DnaK de bacteria (E. coli), tiene una comunicación alostérica entre los dos dominios a través de un residuo de Prolina en la posición 143, pero los residuos involucrados en la comunicación inter-dominios de BiP no se han estudiado. En este trabajo se usó BiP de levadura (S. cerevisiae) y se estudió la comunicación alostérica entre SBD y NBD haciendo una comparación directa entre BiP y DnaK en su secuencia de aminoácidos. Se generó una mutación sitio dirigida de BiP, cambiando la Prolina 193 (equivalente a la 143 de DnaK) por una Glicina en la misma posición a través de partidores diseñados por herramientas bioinformáticas como PDB (Protein Data Bank) y BLAST (Basic Local Alignment Search Tool). Luego, para obtener más copias del ADN mutado de BiP de levadura, se utilizó la línea celular de bacterias XL10. Por otra parte, el ADN mutado de BiP se traduce a proteínas por la línea celular de bacterias BL21. Una vez sobre expresada ambas proteínas, éstas se purifican mediante cromatografía de afinidad utilizando una columna pre empaquetada con Níquel. Una vez eluidas las proteínas, BiP WT y su mutante se caracterizaron por dicroísmo circular, demostrando que su estructura no se modifica por la mutación sitio dirigida. Para saber el rol del residuo de Prolina mutado en la comunicación entre dominios de la chaperona, se realizó un ensayo cinético acoplado a enzimas auxiliares para el cálculo de los parámetros cinéticos de las proteínas en presencia y ausencia de un sustrato peptídico activador de BiP (HTFPAVL). Se demostró que BiP WT presento 4 veces mayor actividad enzimática (7.7e-5 μmol/min) que P193G (1.6e-5 μmol/min). Además, la interacción del péptido activador aumentó la actividad enzimática de BiP nativa pero no mostró efecto en la actividad de la mutante de BiP P193G. En términos de afinidad por ATP (Km) BiP nativa presentó mayor afinidad (24 μM) a diferencia de P193G (13μM), pero en condición de presencia del péptido activador la mutante P193G presentó un aumento de 4 veces en la afinidad por ATP (45 μM). Estos resultados nos dan una idea por primera vez de que el residuo de Prolina 193 puede está involucrado en la comunicación alostérica inter dominios en la proteína BiP.

BiP is a chaperone belonging to the Hsp70 family (Heat shock protein 70) that is involved in the regulation of important biological processes such as the synthesis, folding, translocation and degradation of other proteins in the endoplasmic reticulum of eukaryotic cells. This chaperone has two interconnected domains to modulate its catalytic activity; a Nucleotide Binding Domain (NBD), at the N-terminus, which interacts with nucleotides, for example, hydrolyzing ATP and binding ADP, and the Substrate Binding Domain (SBD), at the C-terminus, which binds unfolded proteins. In previous studies, it has been shown that a protein from the same family, DnaK from bacteria (E. coli), has allosteric communication between the two domains through a Proline residue in the position 143, but the residues involved in BiP interdomain communication have not been studied. In this work we use BiP from S. cerevisiae, a eukaryotic organism closer to humans than bacteria, and study the allosteric communication between SBD and NBD by doing a direct comparison between the yeast BiP and DnaK in their aminoacidic sequence. We generate a site directed mutation of BiP, changing the Proline 193 (equivalent to the 143 from DnaK) for a Glycine in the same position through primers designed by bioinformatics tool such as PDB (Protein Data Bank) and BLAST (Basic Local Alignment Search Tool). Then, to obtain more copies of the mutated DNA of yeast BiP, the XL10 bacteria cell line was used. Subsequently, the mutated BiP DNA is translated into proteins by the BL21 bacterial cell line. Once both proteins are overexpressed, the proteins are purified by affinity chromatography using a pre-packed column with Nickel. Once the proteins were eluted, BiP WT and its mutant were characterized by circular dichroism, demonstrating that their structure are not modified by the site-directed mutation. To determine the role of the mutated Proline residue in the communication between chaperone domains, a kinetic coupled assay with auxiliary enzymes was performed to calculate the kinetic parameters of the proteins in the presence and absence of a BiP-activating peptide substrate (HTFPAVL). It was shown that BiP WT presented 4 times greater enzymatic activity (7.7e-5 μmol/min) than P193G (1.6e-5 μmol/min). In addition, the activator peptide interaction increased the enzymatic activity of native BiP but did not show an effect on the activity of the BiP mutant P193G. In terms of affinity for ATP (Km), native BiP presented a higher affinity (24 μM) than P193G (13 μM), but in the presence of the activating peptide, the P193G mutant presented a 4-fold increase in affinity for ATP (45 μM), these results give us insight for the first time that the residue Proline 193 may be involved in inter-domain allosteric communication in the BiP protein.