Evaluación de la administración de beta-hidroxibutirato y activación de la vía dependiente de cAMP en la función de transporte de glutamato asociado a senescencia en astrocitos

Abstract

Los astrocitos son un tipo celular esencial en el sistema nervioso central (SNC). Participan en numerosos eventos celulares, incluyendo el correcto funcionamiento de la sinapsis tripartita y la mantención del fenotipo neuronal. Así, alteraciones en los astrocitos pueden conducir a consecuencias deletéreas para el SNC. En ese contexto, reportes indican que astrocitos senescentes o envejecidos presentan una disminución de los transportadores de glutamato (GLT1 y GLAST), lo que se relaciona con una mayor susceptibilidad a procesos de excitotoxicidad neuronal. Reportes de ensayos in vitro han indicado que la activación de vías de señalización dependientes de cAMP aumenta la expresión de los transportadores de glutamato en astrocitos primarios de ratón y promueven la aparición de un fenotipo de astrocitos maduro, asociado a procesos de estelación. Así, la modulación de vías que promueven un aumento en cAMP podría recatar la perdida de función de los transportadores de glutamato asociada a senescencia o envejecimiento. Reportes recientes y datos no publicados de nuestro laboratorio indican que la administración de dieta cetogénica/cuerpos cetónicos promueve la activación de vías dependientes de cAMP. Dada la importancia de los transportadores de glutamato en astrocitos y su relación con las vías activadas por cAMP, nosotros propusimos estudiar las posibles funciones de cuerpos cetónicos específicamente en cultivos primarios de astrocito. Para ello, se administró el cuerpo cetónico beta-hidroxibutirato (BHB) por 24 horas en astrocitos controles y senescentes, evaluando cambios en los niveles de cAMP además de determinar la activación de PKA, a través de ensayos de ELISA competitivo y sensores FRET. Se evaluó cambios en la expresión, y localización de los transportadores de glutamato GLT1 y GLAST, a través de ensayos inmunocitoquímicos como Western-blot e inmunofluorescencias. Los ensayos fueron realizados en un numero de dos replicas biológicas, a partir de las cuales los resultados muestran una tendencia a aumentar las concentraciones de cAMP intracelular en astrocitos primarios control, mostrando diferencias significativas, contrario a lo que se observa en astrocitos senescentes. Por otro lado, no se observa un aumento considerable en la actividad de PKA tanto en astrocitos primarios control como senescentes tratados con BHB. En cuanto a la detección de los transportadores se observa un aumento en la detección de GLT-1 en astrocitos primarios control, tratados con BHB, contrario a lo que se observa en astrocitos senescentes, sin observar diferencias significativas. En cuanto a GLAST se observa un aumento en astrocitos control y senescentes, mostrando diferencias significativas en estos últimos. Resultados de esta investigación muestran efectos diferenciales en astrocitos control y senescentes tratados con BHB. Y aunque se considera que el cAMP tiene efectos beneficiosos para células y organismos envejecidos, es posible que la senescencia interfiera con el impacto positivo esperado de BHB debido a cambios metabólicos que ocurren durante la senescencia. Esto podría ser un aspecto relevante para investigar con mayor profundidad en el futuro, con el objetivo de desarrollar tratamientos senomórficos

Astrocytes are an essential cell type in central nervous system (CNS). They participate in numerous cellular events, including the correct functionally of the tripartite synapse and the maintenance of the neuronal phenotype. Thus, alterations in astrocytes can lead to deleterious consequences for the CNS. In this context, reports indicate that senescent or aged astrocytes show a decrease in glutamate transporters (GLT1 and GLAST), which related to an increased susceptibility to neuronal excitotoxicity processes. Reports from in vitro assays have indicated that activation of cAMP-dependent signaling pathways increases the expression of glutamate transporters in primary mouse astrocytes and promotes the appearance of a mature astrocyte phenotype, associated with stellate processes. Thus, modulation of pathways that promote an increase in cAMP could rescue the loss of function of glutamate transporters associated with senescence or aging. Recent reports and unpublished data from our laboratory indicate that the administration of ketogenic diet/ketotic antibodies promotes the activation of cAMP dependent pathways. Given the importance of glutamate transporters in astrocytes and their relationship to cAMP-activated pathways, we proposed to study the possible functions of ketone bodies specifically in primary astrocyte cultures. To this end, we administered the ketone body beta-hydroxybutyrate (BHB) for 24 hours in control and senescent astrocytes, evaluating changes in cAMP levels in addition to determining PKA activation, through competitive ELISA assays and FRET sensors. Changes in the expression and localization of glutamate transporters GLT1 and GLAST were evaluated by immunocytochemical assays such as Western-blot and immunofluorescence. The assays were performed in several two biological replicates, from which the results show a tendency to increase intracellular cAMP concentrations in primary control astrocytes, showing significant differences, contrary to what is observed in senescent astrocytes. On the other hand, no considerable increase in PKA activity is observed in both control and senescent primary astrocytes treated with BHB. Regarding the detection of transporters, an increase in GLT-1 detection is observed in control primary astrocytes treated with BHB, contrary to what is observed in senescent astrocytes, with no significant differences. As for GLAST, an increase is observed in control and senescent astrocytes, showing significant differences in the latter. Results of this research show differential effects in control and senescent astrocytes treated with BHB. And although cAMP is considered to have beneficial effects for aging cells and organisms, it is possible that senescence interferes with the expected positive impact of BHB due to metabolic changes that occur during senescence. This could be a relevant aspect to investigate further in the future, with the aim of developing senomorphic treatments