Expresión de los factores de transcripción SOX5 y Twist y su relación con quimioresistencia en modelos in vitro de cáncer gástrico

Abstract

El cáncer gástrico (GC) es una de las enfermedades malignas con mayor incidencia en la actualidad. Con más de un millón de casos surgiendo cada año, este tipo de cáncer es el quinto más prevalente y, con más de ochocientos mil fallecimientos anuales, es el tercer cáncer con mayor mortalidad a nivel mundial. Esto último es debido principalmente a que este expone una sintomatología muy inespecífica y tardía. Estudios dan cuenta que 50% de los pacientes presentan síntomas distintivos cuando estos ya se encontraban en la etapa IV de la enfermedad (Avanzado). Actualmente, la quimioterapia es el único tratamiento contra el CG, esta de manera neoadyuvante/adyuvante o como principal terapia de tratamiento, en etapas más avanzadas. Los agentes químicos más utilizados en este tipo de terapia corresponden a Oxaliplatino y 5-Fluororacilo (5-FU), dispuestos en régimen como FOLFOX. La resistencia a este tipo de tratamiento a nivel mundial es preocupante, destacándose que el 90% de las muertes de pacientes con cáncer es debido a la generación de un fenotipo de multiresistencia a drogas (MDR). La aparición de este fenotipo MDR está estrechamente asociado con la progresión del cáncer a uno más agresivo e invasivo, que puede ocurrir mediante la activación de la transición epitelio mesénquima (TEM) y la aparición de Cancer Stem Cells (CSC). En los últimos años se ha descrito que SOX5, un factor de transcripción perteneciente a la familia de proteínas sex-determining region Y (Sry)-box-containing, se encontraría sobreexpresado en distintos tipos de cáncer, promoviendo la aparición de un fenotipo más invasivo y metastásicos en líneas celulares de varios tipos de cánceres, incluyendo CG. Específicamente, en CG, la expresión de SOX5 sería responsable de causar una mayor agresividad debido a la activación del regulador maestro de la TEM , Twist1. También, se ha observado que una sobreexpresión de Twist1 también está asociado a una peor prognosis para el paciente en varios tipos de cáncer. Cabe destacar, que en CG se desconoce la participación de SOX5 y Twist en quimioresistencia. De acuerdo con los antecedentes presentados, la hipótesis de trabajo en este proyecto es: “La expresión de los factores de transcripción SOX5 y Twist estarían asociados con la quimioresistencia en modelos in vitro de cáncer gástrico”. El objetivo general es evaluar la asociación entre SOX5 y Twist con el fenotipo MDR y la quimioresistencia en CG. Para esto, se trabajó con líneas celulares de cáncer gástrico (AGS y MKN-45). Primero se realizó la detección de SOX5/Twist en las líneas celulares comerciales a través de RT-qPCR, Western Blot (WB) e inmunofluorescencia (IF). Posteriormente, a través de ensayos de citotoxicidad, se evaluó la resistencia (sobrevida por MTT) a tratamiento FOLFOX que se utiliza en pacientes con CG y su asociación con la expresión de SOX5 y Twist1. Por último, en las líneas celulares se buscó asociar los niveles de SOX5 encontrados con la presencia de marcadores de MDR, como las glicoproteínas p-gp y marcadores de TEM (Twist1, Snail, Zeb1) y CSC. Los resultados obtenidos indican que en la línea con mayor expresión de SOX5 (AGS), posee un fenotipo más invasivo y también una mayor expresión de la proteína TWIST (junto a una mayor co-localización en el núcleo), todo esto al compararlo con la línea MKN-45. Finalmente, los resultados del ensayo MTT señalaron que AGS era una línea celular más quimioresistente a tratamientos con 5-FU y Oxaliplatino, tanto en incubaciones separadas como combinadas (asemejando a la terapia FOLFOX). En resumen, la línea AGS con mayor expresión de SOX5 y TWIST presenta un fenotipo de quimioresistencia a FOLFOX en GC de cáncer avanzado con mayor expresión de proteínas de la familia MDR, proteínas asociadas a TEM y positividad para marcadores de CSC. Los resultados de esta investigación podrían ser fundamentales para relacionar el factor SOX5 y el regulador Twist con la quimioresistencia en CG. Esto sería de gran importancia para el trabajo en clínica de la enfermedad, ya que este factor en un futuro podría considerarse como un marcador de la quimioresistencia en los pacientes, promoviendo la utilización de terapias nuevas o focalizadas para tratar la enfermedad en etapa avanzada.

Gastric Cancer (GC) is one of the malignancies with the highest incidence worldwide. Currently being the fifth type of cancer with most cases each year and the third one with most deaths worldwide per year. This last part is mainly because of the late and nonspecific symptoms of the disease. Literature presents that 50% of the GC patients show a distinctive symptomatology when they have already entered a Stage IV GC. (Advanced Cancer). Currently, chemotherapy is the only treatment against GC, it can be used in a neoadjuvant/adjuvant way or as an only way of treatment. The chemical agents most utilized in this treatment are Oxaliplatin and 5-Fluoruacile on a FOLFOX regimen. Resistance against this type of treatment has caused medical alarms worldwide, denoting that 90% of the cancer’s patients’ deaths are product of the acquisition of a multi-drug resistant phenotype (MDR). The appearance of this phenotype is widely related to the cancer progression to one more aggressive and invasive, that can happen because of the activation of the Epithelium-Mesenchyme transition and the emergence of Cancer Stem Cells (CSCs). In recent years, SOX5, a transcription factor from the sex determining region Y (Sry)-box-containing family of proteins has been investigated as a factor that is overexpressed in several types of cancer, promoting the appearance of an aggressive phenotype and metastasis on various cancer cell lines, including gastric. More specifically, in GC it has been observed that SOX5 it’s responsible of a higher aggressiveness caused by the activation of an EMT master regulator, Twist1. Also, it has been described that a Twist overexpression has also been associated with a worse prognosis in several types of cancer-. It is worth noting that in GC is unknown if there is a role for SOX5 and Twist1 in relation to chemoresistance. The hypothesis of this project was “The expression of the transcription factors SOX5 and Twist are associated with chemoresistance on in vitro models of gastric cancer”. The general objective was to evaluate the relation between SOX5, Twist1 and the MDR phenotype with chemoresistance in GC cell lines. To do it, we worked with two GC cell lines (AGS and MKN-45). First, the detection of SOX5 and Twist was realized in these two lines via RT-qPCR, Western Blot (WB) and immunofluorescence. After the latter, via MTT Cytotoxicity assays, we evaluated the resistance to FOLFOX treatment utilized on GC patients and the relation of the results with the levels of SOX5 and Twist. Finally, we analyzed the presence of MDR markers (such as the p-gp glycoprotein), EMT markers (Snail, Twist, ZEB1) y CSC antigens and made the association between the values detected and the levels of SOX5 in the two cell lines The results showed that the cell line with a higher expression of SOX5 (AGS) presents a more invasive and mesenchymal phenotype of GC (this thanks to the analysis of the EMT and CSC’s markers mentioned before), also, a higher expression of the TWIST protein (with a higher nucleus co-localization) was noticed, all of this after being compared with the MKN-45 line. Finally, the results of the MTT assay detected that AGS was more chemoresistant to treatments with 5-FU and Oxaliplatin, both separately and synergistically (like the FOLFOX regimen). In Summary, the GC cell line with a higher expression of SOX5 presented an advanced cancer phenotype that relates to resistance to the FOLFOX chemotherapy. The results of this investigation could be relevant for the relation between the SOX5 transcription factor and Twist with the chemoresistance in GC. This could be of great medical importance for the research works of this disease. This because in the future this factor could be consider as a chemoresistance marker on patients, promoting the use of alternative therapies for the treatment of the disease.