Verificación in vivo de un método de screening microbiológico para la detección de residuos de antimicrobianos en deyecciones de pollos broiler y su confirmación por cromatografía líquida acoplada a Espectrometría de masas (LC-MS/MS)

Abstract

A nivel mundial, una de las principales preocupaciones de las autoridades reguladoras es la presencia de residuos de antimicrobianos en los alimentos y la necesidad de establecer programas adecuados para monitorear el peligro. La mayoría de los programas de vigilancia, se centran en la detección de los residuos de los antimicrobianos en el producto final, empleando matrices invasivas. Hasta la fecha, no existen métodos de screening microbiológico, que estén registrados para la detección de residuos de antimicrobianos en matrices no invasivas, es decir, que no requieren que el animal sea faenado para su obtención, como son las heces de los animales de producción. Por esto, el objetivo de esta memoria de título fue verificar in vivo una metodología de screening microbiológico, para la detección de seis familias de antimicrobianos en deyecciones de pollos broiler y posteriormente se cuantificó la concentración de los residuos. Para el desarrollo de esta tesis, se utilizaron 48 pollos broiler machos de genética Ross 308, los que se distribuyeron en seis grupos experimentales, compuestos por seis animales tratados y dos animales sin tratar, que correspondieron a los blancos. Todos los antimicrobianos se administraron vía oral mediante una sonda oro-esofágica, excepto en la ampicilina; ya que al no existir una formulación farmacéutica oral autorizada para pollos broiler se utilizó un estándar certificado, el cual fue administrado vía endovenosa en dosis única. Posteriormente, se recolectaron las muestras de deyecciones a las cuatro y ocho horas post-tratamiento, durante dos días consecutivos. En el caso de la ampicilina, se realizaron los muestreos a las horas uno, dos, cuatro y seis post-tratamiento, completando cuatro puntos de muestreo. Posteriormente, se realizó la extracción de las muestras mediante el método de screening microbiológico, se midió el radio del halo de inhibición y este se registró en milímetros. Las muestras positivas se confirmaron mediante LC-MS/MS, el método de extracción utilizado correspondió a un método analítico multi-residual implementado y validado previamente y se comparó si los resultados obtenidos mediante LC-MS/MS eran mayores o iguales a la capacidad de detección (CCβ) del método de screening microbiológico. Respecto a los resultados, para enrofloxacino y su metabolito activo ciprofloxacino, oxitetracicilina y su epímero 4-epi-oxitetraciclina, sulfacloropiridazina, eritromicina, ampicilina y lincomicina, las muestras analizadas mediante el método de screening II microbiológico provenientes de aves tratadas fueron positivas y las concentraciones cuantificadas por LC-MS/MS fueron superiores a la CCβ del método de screening microbiológico. Respecto a los blancos, todos los antimicrobianos en estudio fueron negativos al screening microbiológico y no se detectaron concentraciones de los residuos mediante LC-MS/MS. En conclusión, la metodología de screening microbiológico es capaz de detectar residuos de antimicrobianos en deyecciones de pollos tratados y existe concordancia entre lo obtenido en el método de screening microbiológico con los resultados obtenidos mediante LC-MS/MS

Globally, one of the main concerns of regulatory authorities is the presence of antimicrobial residues in food and the need to establish adequate programs to monitor the hazard. Most surveillance programs focus on the detection of antimicrobial residues in the final product using invasive matrices. To date, there are no microbiological screening methods registered for the detection of antimicrobial residues in non-invasive matrices, i.e., those that do not require the animal to be slaughtered to obtain them, such as feces from production animals. Therefore, the objective of this thesis was to verify in vivo a microbiological screening methodology for the detection of six families of antimicrobials in broiler chicken droppings and subsequently the concentration of the residues was quantified. For the development of this thesis, 48 male broiler chickens of Ross 308 genetics were used, which were distributed in six experimental groups, composed of six treated animals and two untreated animals, which corresponded to the blanks. All the antimicrobials were administered orally through an oro-esophageal tube, except for ampicillin; since there was no authorized oral pharmaceutical formulation for broiler chickens, a certified standard was used, which was administered intravenously in a single dose. Subsequently, droppings samples were collected at four and eight hours post-treatment, for two consecutive days. In the case of ampicillin, samples were taken at one, two, four and six hours post-treatment, completing four sampling points. Subsequently, samples were extracted using the microbiological screening method, the inhibition halo radius was measured and recorded in millimeters. Positive samples were confirmed by LC-MS/MS, the extraction method used corresponded to a previously implemented and validated multi-residual analytical method and it was compared whether the results obtained by LC-MS/MS were greater than or equal to the detection capacity (CCβ) of the microbiological screening method. Regarding the results, for enrofloxacin and its active metabolite ciprofloxacin, oxytetracycline and its epimer 4-epi-oxytetracycline, sulfachloropyridazine, erythromycin, ampicillin and lincomycin, the samples analyzed by the microbiological screening method from treated birds were positive and the concentrations quantified by LC-MS/MS were higher than the CCβ of the microbiological screening method. Regarding the blanks, all IV antimicrobials under study were negative to the microbiological screening and no concentrations of the residues were detected by LC-MS/MS. In conclusion, the microbiological screening methodology is capable of detecting antimicrobial residues in treated chicken droppings and there is concordance between the results obtained in the microbiological screening method and the results obtained by LC-MS/MS