Nuevas nanoemulsiones basadas en complejos solubles de quenopodina-quitosano y quenopodina-alginato como matrices de liberación controlada de quercetina a nivel colónico

Abstract

Durante las últimas décadas, las combinaciones entre proteínas y polisacáridos juegan un papel clave en la estructuración y estabilización de los sistemas alimentarios, así como en los sistemas de liberación de fármacos. Los complejos solubles entre proteínas y polisacáridos se producen a través de interacciones atractivas relativamente fuertes sin separación de fases, y pueden ser útiles en el diseño racional de nanoemulsiones (Nes) para encapsular fármacos o bioactivos insolubles en agua. Por otro lado, las tasas de enfermedades inflamatorias intestinales (EII) están aumentando a nivel mundial y su tratamiento mediante fármacos antiinflamatorios como los corticoides, tienen efectos secundarios no deseados. Por tanto, existe una necesidad de nuevas opciones para el tratamiento para los pacientes con EII, y los flavonoides como la quercetina han demostrado la capacidad de atenuar la inflamación en modelos experimentales de EII. Entonces, el objetivo principal del presente trabajo fue desarrollar nanoemulsiones basadas en complejos solubles quenopodina-quitosano y quenopodina-alginato, así como su caracterización como plataforma de liberación colónica de quercetina. Se realizaron diferentes técnicas de caracterización como potencial zeta, tamaño de partícula hidrodinámico, conductividad, espectroscopia de dicroísmo circular, espectroscopia de fluorescencia, análisis térmico y espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FTIR) para demostrar la existencia de interacciones atractivas entre la proteína y los polisacáridos. Los complejos QPI-Qo y QPI-Alg en una proporción de mezcla 2:3 fueron seleccionados para caracterizaciones adicionales mediante la técnica de DRX y análisis microestructurales (SEM y AFM), y fueron posteriormente utilizados para desarrollar Nes cargados con quercetina. Formulaciones cargadas con quercetina se obtuvieron mediante emulsificación espontánea y métodos de alta energía utilizando homogeneización por de ultraturrax y/o ultrasonido. Las nanoemulsiones se caracterizaron en términos de tamaño, potencial zeta, índice de polidispersidad (PDI), DSC y FTIR, y se les determinó la eficiencia de encapsulación, capacidad de carga y rendimiento. Se realizaron pruebas de citotoxicidad y permeabilidad in vitro en células HT-29 y Caco-2 y, respectivamente. Las interacciones electrostáticas y los enlaces de hidrógeno fueron los principales responsables de la formación de complejos solubles entre quenopodina y quitosano (QPI-Qo), mientras que en los complejos quenopodina-alginato (QPI-Alg) se detectaron fuertes interacciones hidrofóbicas y enlaces de hidrógeno, con una menor prevalencia de interacciones electrostáticos. Los complejos QPI-Qo y QPI-Alg a una proporción de mezcla de 2:3 resultaron ser complejos binarios cargados positiva/negativamente, con tamaños menores de 300 nm con cambios en la estructura secundaria y estabilidad térmica mejorada de la proteína. El método de homogeneización por ultraturrax/ultrasonido mostró los mejores resultados en cuanto a eficiencia de encapsulación (53,51 y 63,40%), capacidad de carga (6,34 y 7,49%) y rendimiento (93,07 y 92,08%), y las formulaciones finales (Ne QPI-Qo 5 y Ne QPI-Alg 5) consistieron en 0,49% de Miglyol 812, 120 ppm de Pluronic F-127, 150 ppm de quercetina y complejos QPI-Qo y QPI-Alg al 0,1% en agua desionizada. Ne QPI-Qo 5 mostró un tamaño de 304,93 nm, potencial zeta de 42,33 mV y un valor de PDI de 0,26, mientras que Ne QPI-Alg 5 presentó valores de 257,40 nm, -40,03 mV y 0,25 para tamaño, potencial zeta y PDI, respectivamente. Los análisis de DSC y FTIR sugirieron la inclusión de quercetina dentro de las Nes con una transición del estado cristalino al amorfo. El estudio de viabilidad celular indicó un perfil de citotoxicidad muy bajo para las formulaciones Ne QPI-Qo 5 y Ne QPI-Alg 5 en las células HT-29, y la presencia de quercetina en las Nes incrementó la permeabilidad en células Caco-2 a las 24 horas de incubación. Nuestros hallazgos sugieren que los complejos QPI-Qo y QPI-Alg pueden ser apropiados para encapsular flavonoides como la quercetina mediante el desarrollo de nanoemulsiones. Las formulaciones cargadas con flavonoides hechas a partir de biopolímeros renovables deben ser consideradas por la industria alimentaria y farmacéutica como suplementos dietéticos en el tratamiento de las EII y otras enfermedades.

Over the last decades, the combinations of proteins and polysaccharides play a key role in the structuration and stabilization of food systems as well as drug delivery systems. Soluble complexes between proteins and polysaccharides occur through relatively strong attractive interactions with no phase separation, and could be useful to rationally designing nanoemulsions (Nes) to trap water-insoluble drugs or bioactives. On the other hand, rates of inflammatory bowel disease (IBD) are increasing globally, and its remission is achieved using anti-inflammatory drugs such as corticoids, often with undesirable systemic effects. Thus, there is a need for novel treatment options for patients with IBD, and flavonoids such as quercetin have demonstrated remarkable effects capable of attenuating inflammation in experimental models of IBD. Then, the main objective of the present work aims at the development of a novel Nes based on soluble chenopodin-chitosan and chenopodin-alginate complexes, as well as their characterization as colonic delivery platform of quercetin. Different characterization techniques such as electrical zeta potential, hydrodynamic, particle size, conductivity, circular dichroism spectroscopy, fluorescence spectroscopy, thermal analysis and infrared spectroscopy (FTIR) were performed to demonstrate the existence of attractive interactions between the protein and polysaccharides. QPI-Qo and QPI-Alg complexes at mixing ratio 2:3 were selected for further characterizations by DRX and microstructural (SEM and AFM), and were also used for to develop quercetin-loaded Nes. Quercetin loaded formulation were produced by spontaneous emulsification and high energy methods using homogenization with ultraturrax and/or ultrasound techniques. Nanoemulsions were characterized in terms of size, zeta potential, polydispersity index (PDI), DSC and FTIR techniques, and assessed for efficiency of encapsulation, loading capacity and yield. In vitro cytotoxicity and permeability tests were performed in HT-29 and Caco-2 and cells, respectively. Electrostatic interactions and hydrogen bonds were the main responsible for the soluble complex formation between chenopodin and chitosan (QPI-Qo), while in chenopodin-alginate (QPI-Alg) complexes were detected strong hydrophobic interactions and hydrogen bonds, with a lower prevalence of electrostatic interactions. QPI-Qo and QPI-Alg complexes at 2:3 mixing ratio resulted in positively/negatively charged binary complexes lower of ˂300 nm, that led to the changed secondary structure and enhanced thermal stability of the protein. The homogenization by ultraturrax/ultrasound method showed the best results in terms of efficiency of encapsulation (53.51 and 63.40%), loading capacity (6.34 and 7.49%) and yield (93.07 and 92.08%), and the final formulations (Ne QPI-Qo 5 and Ne QPI-Alg 5) consisted of 0,49% of Miglyol 812, 120 ppm of Pluronic F-127, 150 ppm of quercetin and QPI-Qo and QPI-Alg complexes at 0.1% in deionized water. Ne QPI-Qo 5 showed a size of 304.93 nm, zeta potential of 42.33 mV and PDI value of 0.26, while Ne QPI-Alg 5 resulted in values of 257.40 nm, -40.03 mV and 0.25 for size, zeta potential and PDI, respectively. DSC and FTIR analyses suggested the inclusion of quercetin within the Nes with a transition from the crystalline to the amorphous state. The cell viability study indicated a very low cytotoxicity profile for the Ne QPI-Qo 5 and Ne QPI-Alg 5 formulations for the HT-29 cells, and the presence of quercetin in the Nes increase the permeability in Caco-2 cells at 24 hours of incubation. Our findings suggest that QPI-Qo and QPI-Alg complexes can be suitable for encapsulation of flavonoids such as quercetin through the development of nanoemulsions. flavonoids loaded formulations made from renewable biopolymers must be considered by food and pharmaceutical industry as dietary supplements in treatment of IBD and other diseases.