Detección de un polimorfismo marcador de sexo mediante CRISPR-CAS 12A en salmón coho

Abstract

En salmon Coho se ha identificado un marcador genético asociado al sexo que corresponde a la variación estructural del gen GH-2. Esta variante permite determinar el sexo considerando diversas metodologías, tales como PCR asociado a un ensayo de enzima de restricción y “high resolution melting” (HRM), no obstante requieren de equipos especializados y en algunos casos son muy laboriosas de implementar en la práctica. El sistema CRISPR-Cas permite la detección de nucleótidos utilizando el mecanismo de acción de la enzima Cas 12a, que reconoce una secuencia de ADN específica dirigido por un ARN guía, la cual desencadena una actividad colateral de corte permitiendo a través de reporteros detectar mediante fluorescencia las secuencia objetivo. Dado que esta técnica es posible de realizar de manera portátil sin comprometer parámetros analíticos, se propone a CRISPR-Cas 12a como candidato para la detección de nucleótidos. El objetivo de este trabajo es desarrollar un sistema de detección de secuencias especificas asociadas al sexo en salmon Coho mediante CRISPR-Cas 12a, acoplado a PCR o a la amplificación con recombinasa polimerasa (RPA), permitiendo la detección mediante fluorescencia directa. En primer lugar, se determinó el sexo de muestras de individuos mediante ensayo de restricción HinfI, y se realizó el procedimiento de secuenciación SANGER para determinar los controles de reacción. Además, se desarrolló una prueba de identificación de sexo mediante HRM la cual es nuestro ensayo de referencia o “gold standard”. El sistema CRISPR/cas12 se implementó para la detección de una inserción presente en machos, dónde se diseñó un ARN guía adyacente a un sitio PAM. La visualización positiva de la fluorescencia discernible mediante un transiluminador UV se obtuvo utilizando relaciones mínimas de 20 nM, del complejo ARN guía y enzima Cas 12a, considerando una concentración mínima del amplicón obtenido mediante PCR a una concentración de 0,1 ng/μl. Los resultados fueron 10 positivos y 10 negativos considerando muestras de individuos control, definidas como macho y hembras respectivamente. Se generó un prototipo de campo mediante un ensayo CRISPR-Cas 12a acoplado a RPA. Los resultados señalaron diferencias en fluorescencia significativamente más altas en machos cuando se comparan con hembras. Al aplicar las diferentes técnicas de determinación de sexo: ensayo de restricción mediante HinfI, HRM, CRISPR-Cas 12a acoplado a PCR y CRISPR-Cas 12a acoplado a RPA, se logró un 100% de consistencia entre los distintos análisis. En conclusión, se desarrolló un prototipo de campo para la determinación del sexo en salmón Coho, el cual requiere como insumo el ADN de animales, obtenidos mediante un procedimiento estándar de extracción. Este método presenta un 100% de eficiencia para la detección temprana del sexo en esta especie, sin la necesidad de esperar grados avanzados de maduración gonadal, es de relevante para la implementación de poblaciones monosexo, lo cual permite un mejoramiento significativo de la rentabilidad del sector.

A sex-associated genetic marker has been identified in Coho salmon which corresponds to the structural variation of the GH-2 gene. This variant allows sex determination using different methodologies, such as PCR associated with a restriction enzyme assay and high resolution melting (HRM), but they require specialised equipment and in some cases are very laborious to implement in practice. The CRISPR-Cas system enables the detection of nucleotides using the mechanism of action of the Cas 12a enzyme, which recognises a specific DNA sequence directed by a guide RNA, which triggers a cleavage collateral activity allowing the target sequence to be detected by fluorescence through reporters. Since this technique can be performed in a portable format without compromising analytical parameters, CRISPR-Cas 12a is proposed as a candidate for nucleotide detection. The objective of this work is to develop a system for detection of sex-specific sequences in Coho salmon based on CRISPR-Cas 12a, linked to PCR or recombinase polymerase amplification (RPA), enabling detection by direct fluorescence. The sex of individual samples was determined by HinfI restriction assay, and the SANGER sequencing procedure was performed to determine the reaction controls. In addition, an HRM sex identification test was developed which is our gold standard assay. The CRISPR/cas12 system was implemented, for the detection of an insertion present in males, where a guide RNA was designed adjacent to a PAM site. The positive visualisation of the discernible fluorescence using a UV transilluminator was obtained using minimum ratios of 20 nM of the guide RNA and Cas12a enzyme complex, considering a minimum concentration of the amplicón obtained by conventional PCR at a concentration of 0.1 ng/μl. The results were 10 positive and 10 negative considering samples from control individuals, defined as male and female, respectively. A field prototype was generated using a CRISPR-Cas 12a linked to RPA assay. The results indicated significantly higher fluorescence differences in males when compared to females. When applying the different sex determination techniques: HinfI restriction assay, HRM, CRISPR-Cas 12a coupled to PCR and CRISPR-Cas 12a coupled to RPA, 100% consistency between the different analyses was achieved. In conclusion, a field prototype was developed for sex determination in Coho salmon, which requires as input DNA from animals obtained by a standard extraction procedure. This method is 100% efficient for the early detection of sex in this species, without the need to wait for advanced degrees of gonadal maturation, and is relevant for the implementation of monosex populations, which allows a significant improvement in the profitability of the sector.