Caracterización estructural, funcional y farmacológica de un anticuerpo monoclonal humano contra la proteína sST2 en modelos de colitis ulcerosa

Abstract

La colitis ulcerosa (CU) es uno de los principales tipos de enfermedades inflamatorias intestinales (EII), que tiene una incidencia creciente en Chile durante los últimos años, y una etiología multifactorial que involucra: alteraciones genéticas, hábitos alimenticios, cambios en la microbiota intestinal, así como, un desbalance de la respuesta inflamatoria en la mucosa colónica. El diagnóstico de la CU es complejo, requiere exámenes y procedimientos que no son parte de los controles médicos rutinarios, por lo que en algunas ocasiones se realiza en estadios avanzados de la enfermedad. Durante los últimos años, nuevos biomarcadores han permitido apoyar el diagnóstico de la patología, así como también, evaluar la respuesta al tratamiento farmacológico. Entre estos marcadores, destaca la proteína ST2 (IL1RL1) cuyas isoformas más abundantes son, ST2L (receptor de membrana) y sST2 (receptor soluble), que comparten un ligando en común conocido como IL-33 (interleuquina alarmina). El receptor sST2, bloquea las acciones de IL-33 en el contexto de la CU, impidiendo las funciones de control del estado inflamatorio y la promoción de mecanismos de reparación de la mucosa intestinal. En el laboratorio de Inmunidad Innata de la Universidad de Chile, se ha descrito largamente sobre el rol del eje ST2L/IL-33 en el desarrollo y grado de actividad de la CU, y se ha creado un anticuerpo monoclonal humano (mAb) con potenciales acciones moduladoras de sST2 a nivel intestinal, con un alto grado de selectividad y potencia. Los mAb constituyen la última innovación en el tratamiento de CU, sin embargo, muchos de los medicamentos actualmente introducidos en el tratamiento de CU, presentan fallas en la terapia debido a resistencia y efectos adversos. En consecuencia, este mAb humano que se une selectivamente a la proteína sST2, constituiría una alternativa de tratamiento y diagnóstico. Para esto, a partir de una librería de fagos humana, una molécula de un fragmento variable de cadena simple (scFv) o “mini-anticuerpo” contra sST2 fue seleccionada utilizando como epítopo los últimos 5 aminoácidos del extremo carboxilo terminal (SKECF) de la proteína y presentes exclusivamente en esta isoforma. Con la secuencia definida del mini-anticuerpo, denominado scFv-αsST2, se construyó un vector de expresión que permite la expresión de un anticuerpo completamente humano tipo IgG1 (AcHu- αsST2), desde sobrenadantes de cultivos de células CHO-K1 (ovario de hámster chino). En esta tesis se realizó una caracterización funcional, farmacológica y estructural de AcHu- αsST2. Utilizando cultivos de explantes de pacientes con CU y pacientes controles, se demostró que el AcHu- αsST2 revierte la producción de citoquinas aumentando IL-10 y disminuyendo TNFα. Además scFv-αsST2, revierte los efectos de sST2 en cultivos celulares de HMC-1 (mastocitos humanos derivados de leucemia) estimulados con IL-33. Adicionalmente, utilizando modelos estructurales de las proteínas scFv-αsST2 y sST2, se realizó un modelamiento de acoplamiento y dinámica molecular, obteniendo los modelos de interacción más probables y sus energías libres de unión, seleccionándose el complejo de interacción “5”. A partir de este modelo, se determinaron residuos críticos en la unión y afinidad teórica entre la proteína nativa (scFv-αsST2) y variantes de mutación sitio-dirigida, con sST2. Finalmente utilizando resonancia de plasmón superficial, se determinó la afinidad de AcHu-αsST2, scFv-αsST2 y sus variantes de mutación, con la proteína sST2, encontrándose un valor de 11,7 nM para el anticuerpo completo (dentro del rango de anticuerpos comerciales) y un aumento de entre 40 y 60 veces para 3 de las variantes de mutación ensayadas (Var E50Q, Var A183Y y Var S165R/A227H). En conclusión, AcHu-αsST2 se une selectivamente a sST2 con alta afinidad, generando un ambiente anti-inflamatorio en muestras de pacientes con CU; también sus variantes de mutación derivadas de un estudio in silico y experimental demuestran la posible optimización de la molécula para convertirse en una alternativa de tratamiento y pronóstico en CU.