Senescencia de fibroblastos cardiacos de rata adulta inducida por LPS : efecto de Resolvina D1 y el desafío de la autodiferenciación

Abstract

El envejecimiento y la senescencia celular emergen como importantes factores de riesgo en la incidencia y progresión de las enfermedades cardiovasculares (ECV). La adquisición del fenotipo senescente es un proceso multifactorial y complejo que tiene efectos beneficiosos durante procesos reparativos pero cuya mantención en el tiempo resulta en consecuencias negativas. La identificación de aquellas células que presentan el fenotipo senescente se realiza a través de diversos marcadores de senescencia, que deben ser analizados en conjunto para encontrar respuestas certeras. En dicho contexto, la figura del fibroblasto cardíaco (FC) es de relevancia, ya que actúa como célula centinela, al ser capaz de percibir situaciones de daño y participar en la respuesta inflamatoria y reparativa que tiene por objetivo mantener la funcionalidad del corazón. A este respecto, la senescencia temprana de los FC tiene un rol clave en el control de la respuesta reparativa; sin embargo, su prolongación en el tiempo o su inducción de forma crónica podría ser un contribuyente decisivo en la progresión de diversas ECV. En ese sentido, el receptor TLR-4 permite el reconocimiento de estímulos asociados a daño y/o patógenos al desencadenar el inicio de la fase inflamatoria. El lipopolisacárido de bacterias gram negativa (LPS), de amplio uso en nuestro laboratorio, será utilizado como agonista de este receptor debido a su potente efecto proinflamatorio e inductor de senescencia celular en otros tipos celulares. Además, LPS es capaz de activar las vías transduccionales p38MAPK y NF-κB, las cuales participan en la mantención del fenotipo secretor asociado a senescencia (SASP). No obstante, el cultivo en placas rígidas genera estrés mecánico en los FC, lo que promueve su autodiferenciación a MFC y se convierte en una interferente importante en la evaluación de los marcadores de senescencia. Por último, resulta indispensable la búsqueda de alternativas terapéuticas en el control de la senescencia celular crónica. En la actualidad, las investigaciones se centran en fármacos que eliminan células senescentes (senolíticos) y aquellos que alteran la composición del SASP (senostáticos). Resultados previos de nuestro laboratorio muestran que Resolvina D1 (RvD1), posee un notable efecto antinflamatorio en FC tratados con LPS al disminuir significativamente la expresión y secreción de citoquinas, quimioquinas y proteínas de adhesión. Por lo tanto, determinar si RvD1 es capaz de prevenir la inducción de la senescencia en FC por LPS resulta una idea atractiva, considerando el alcance que esta investigación pueda tener el manejo de las ECV. Estos antecedentes nos llevan a formular siguiente hipótesis: “LPS a través de la activación de las vías transduccionales p38MAPK y NF-κB induce una mayor senescencia en fibroblastos cardiacos no autodiferenciados; y la Resolvina D1 previene dicho efecto” Para dar respuesta a esta hipótesis se plantearon los siguientes objetivos: 1. Demostrar que LPS es capaz de inducir senescencia en fibroblastos cardíacos. 2. Demostrar que la prevención de la autodiferenciación de FC a MFC, inducida por el efecto autocrino de TGF-β1, resalta el efecto senescente de LPS. 3. Determinar si LPS induce el fenotipo senescente en fibroblastos cardiacos a través de la activación de las vías p38MAPK y NF-κB. 4. Evaluar si Resolvina D1 previene la senescencia inducida por LPS en fibroblastos cardíacos. El modelo experimental se desarrolló en FC de rata adulta Sprague-Dawley tratados con LPS (1 μg/mL) y se determinaron los niveles proteicos por WB de diversos marcadores de senescencia y vías transduccionales (p16, p21, p53, p-Rb, γH2A.X, Bax, Bcl-xl y VCAM-1; p-p38MAPK y p-NF-κB), actividad SA-β-gal, tamaño celular, heterogeneidad de la población celular y, presencia y/o localización de proteínas por ICQ (γH2A.X, NF-κB y α-SMA). Es importante destacar que las mediciones fueron realizadas en FC autodiferenciados y en FC cuya autodiferenciación fue prevenida con el inhibidor químico SB-431542. Los resultados indican que: • LPS induce un aumento de marcadores de senescencia a las 24 horas (p53, p21, p16 y actividad SA-β-gal), mientras que a 72 horas se observan resultados controversiales con aumentos de p53, actividad SA-β-gal y VCAM-1; disminución de p21 y sin cambios en otros marcadores (p16, γH2A.X, Bax, Bcl-xl y tamaño celular). Observándose un aumento importante en la actividad SA-β-gal y tamaño celular entre los controles, así como también una gran heterogeneidad en la población celular y presencia de MFC (α-SMA). • La prevención de la autodiferenciación reduce tanto el tamaño celular, como la heterogeneidad de la población celular y la presencia de MFC en el control basal. En estas condiciones se observaron mejores diferencias entre el LPS y su control de tiempo en la actividad SA-β-gal y secreción de IL-1β. Se mantiene la tendencia para p53 y VCAM-1. Además, se comienzan a evidenciar incipientes cambios en otros marcadores. • En FC autodiferenciados, LPS promueve la activación temprana de las vías transduccionales p38MAPK y NF-κB, pero solo de NF-κB a 72 horas, mientras que la inhibición de la vías previene el aumento de la actividad SA-β-gal inducida por LPS. La prevención de la autodiferenciación tiene como consecuencia que el tratamiento promueva la activación a 72 horas de p38MAPK y NF-κB. • El pretratamiento con RvD1 previene al aumento de la actividad SA-β-gal en FC cultivados en presencia de SB-431542. Con esto podemos concluir que es necesario optimizar el método de cultivo de los FC ya que el utilizado actualmente, favorece cambios en el fenotipo celular que alteran la evaluación de la senescencia celular inducida por estímulos que no dañan directamente el ADN. Por otro lado, LPS promueve cambios en ciertos marcadores de senescencia (p53, SA-β-gal) sin la activación de la DDR, siendo necesario un tratamiento por una mayor cantidad de días. Además, LPS activa las vías transduccionales que inician y mantienen el SASP y la inhibición de estas previene el aumento de la actividad SA-β-gal. Finalmente, Resolvina D1 demostró tener un efecto preventivo sobre la acción del LPS, pero es necesario profundizar los mecanismos asociados a dicha respuesta.

Aging and cellular senescence emerge as significant risk factors in the incidence and progression of cardiovascular disease (CVD). The acquisition of the senescent phenotype is a multifactorial and complex process that has beneficial effects during reparative processes but whose maintenance over time results in negative consequences. The identification of those cells that display the senescent phenotype is done through several senescence markers, which must be analysed together to provide accurate answers. In this context, the cardiac fibroblast (CF) is of relevance, as it acts as a sentinel cell, being able to perceive situations of damage and participate in the inflammatory and reparative response that aims to maintain the functionality of the heart. In this regard, early CF senescence plays a key role in the control of the reparative response; however, its prolongation over time or its chronic induction could be a decisive contributor to the progression of various CVD. In this context, the TLR-4 receptor enables the recognition of damage- and/or pathogen-associated stimuli by triggering the onset of the inflammatory phase. The gram-negative bacterial lipopolysaccharide (LPS), which is widely used in our laboratory, will be used as an agonist of this receptor due to its potent proinflammatory and cell senescence-inducing effect on other cell types. In addition, LPS is able to activate the p38MAPK and NF-κB transductional pathways, which are involved in the maintenance of the senescence-associated secretory phenotype (SASP). However, culture on rigid plates generates mechanical stress in CF, which promotes their self-differentiation to cardiac myofibroblast (CMF) and becomes an important interferant in the evaluation of senescence markers. Finally, the search for therapeutic alternatives in the control of chronic cellular senescence is essential. Current research focuses on drugs that eliminate senescent cells (senolytics) and those that alter the composition of the SASP (senostatics). Previous results from our laboratory show that Resolvin D1 (RvD1) has a remarkable anti-inflammatory effect in LPS-treated CF by significantly decreasing the expression and secretion of cytokines, chemokines, and adhesion proteins. Therefore, determining whether RvD1 is able to prevent the induction of senescence in CF by LPS is an attractive idea, considering the scope that this research could have in the management of CVD. This background led us to formulate the following hypothesis: "LPS, through activation of p38MAPK and NF-κB signaling pathways, induces increased senescence in non-self-differentiated cardiac fibroblasts; and Resolvin D1 prevents this effect." To answer this hypothesis, the following objectives were proposed: 1. Demonstrate whether LPS is able to induce senescence in cardiac fibroblasts. 2. Demonstrate whether the prevention of self-differentiation of CF to CMF, induced by the autocrine effect of TFG-β1, enhancing the senescent effect of LPS. 3. Determine whether LPS induces the senescent phenotype in cardiac fibroblasts through activation of the p38MAPK and NF-κB pathways. 4. Evaluate whether Resolvin D1 prevents LPS-induced senescence in cardiac fibroblasts. The experimental model was developed in adult Sprague-Dawley rat CF treated with LPS (1 μg/mL), and protein levels were determined by WB of several senescence markers and signaling pathways (p16, p21, p53, p-Rb, γH2A.X, Bax, Bcl-xl, and VCAM-1; p-p38MAPK and p-NF-κB), SA-β-gal activity, cell size, cell population heterogeneity, and presence and/or localisation were determined by ICQ (γH2A.X, NF-κB, and α-SMA). Importantly, measurements were performed on self-differentiated CF and on CF whose self-differentiation was prevented with the chemical inhibitor SB-431542. The results indicate that: • LPS induces an increase in senescence markers at 24 hours (p53, p21, p16, and SA-β-gal activity), while at 72 hours controversial results are observed with increases in p53, SA-β-gal activity, and VCAM-1; decrease in p21, and no changes in other markers (p16, γH2A.X, Bax, Bcl-xl, and cell size). A significant increase in SA-β-gal activity and cell size was observed among controls, as well as a large heterogeneity in the cell population and the presence of CMF (α-SMA). • Prevention of self-differentiation reduces cell size , cell population heterogeneity and the presence of CMF in the basal control. Under these conditions, better differences were observed between LPS and its time control in SA-β-gal activity and IL-1β secretion. The trend for p53 and VCAM-1 is maintained. In addition, incipient changes in other markers are becoming evident. • In self-differentiated CF, LPS promotes the early activation of the p38MAPK and NF-κB signaling pathways, but only NF-κB at 72 hours, while inhibition of the pathways prevents LPS-induced increase in SA-β-gal activity. Prevention of self-differentiation results in that treatment promoting the activation of p38MAPK and NF-κB at 72 hours. • Pretreatment with RvD1 prevents the increase in SA-β-gal activity in CF cultured in presence of SB-431542. With these data we con can conclude that it is necessary to optimise the culture method of CF, as the one currently used to promote changes in the cellular phenotype that alter the assessment of cell senescence induced by stimuli that do not directly damage DNA. On the other hand, LPS promotes changes in certain senescence markers (p53, SA-β-gal) without activation of the DDR, requiring treatment for a greater number of days. In addition, LPS activates signaling pathways that initiate and maintain the SASP, and inhibition of these pathways prevents increased SA-β-gal activity. Finally, Resolvin D1 was shown to have a preventive effect on the action of LPS, but the mechanisms associated with this response need to be further investigated.