Tenascina C en las vesículas extracelulares con Caveolina-1 aumenta la migración/invasión de las células de cáncer de mama mediante su captación dependiente de integrina αvβ3 y promueve la formación de redes vasculares de las células endoteliales

Abstract

El cáncer de mama es uno de los tipos de cáncer de mayor prevalencia y mortalidad a nivel mundial. El desarrollo de la metástasis es responsable del 90% de las muertes asociadas a este cáncer. Durante el desarrollo de la metástasis, las células de cáncer adquieren varias características biológicas, entre ellas aumentan la migración/invasión e inducen la angiogénesis. Caveolina-1 (CAV1) es una proteína que promueve la migración, invasión y el desarrollo de la metástasis de las células de cáncer de mama. La línea celular de cáncer de mama humano de alto potencial metastásico MDA-MB-231, expresa altos niveles de CAV1 y produce vesículas extracelulares (EVs) que contienen CAV1. Las EVs son estructuras delimitadas por bicapas lipídicas que se liberan desde las células y transfieren moléculas bioactivas de una célula a otra, modificando el comportamiento de las células receptoras, contribuyendo así a la progresión del cáncer. Las EVs con CAV1 promueven la migración e invasión de las células de cáncer de mama y se ha demostrado que hay proteínas relacionadas a procesos de adhesión biológica, entre ellas Tenascina C (TNC), que cosegregan con CAV1 en las EVs de las células MDA-MB-231. TNC aumenta la migración de las células de cáncer y promueve características proangiogénicas en células endoteliales. TNC ha sido vinculada con mecanismos moleculares que promueven la motilidad celular a través de la activación de integrina αvβ3. Las integrinas son receptores celulares que median la adhesión a la matriz extracelular, regulan la migración celular y también el desarrollo de la angiogénesis. Se ha reportado que integrina αvβ3 regula positivamente la captación de las EVs por las células MDA-MB-231. La activación de integrina αvβ3 puede ser inhibida mediante el uso de péptidos que contienen el motivo RGD o anticuerpos bloqueantes. Hasta la fecha, se desconoce si TNC contenida en las EVs de células MDA-MB-231 es responsable del aumento de la migración e invasión de las células de cáncer de mama o si promueve características proangiogénesis en células endoteliales. Tampoco se ha estudiado si la captación de las EVs puede ser inhibida mediante el bloqueo farmacológico de la integrina αvβ3. Para responder estas interrogantes proponemos la siguiente hipótesis: Las vesículas extracelulares de células de cáncer de mama que contienen CAV1 y TNC aumentan la migración e invasión de las células de cáncer a través de la captación de las vesículas dependiente de integrina αvβ3 y promueven la formación de redes vasculares en células endoteliales. Para abordar la hipótesis se plantearon los siguientes objetivos específicos: (i) determinar el efecto de TNC contenida en las EVs de células de cáncer de mama que expresan CAV1, en la migración, invasión y migración transendotelial de células de cáncer de mama; (ii) estudiar si la captación de EVs depende de TNC contenida en las EVs y de integrina αvβ3 en las células de cáncer de mama; (iii) evaluar si TNC contenida en las EVs de células de cáncer de mama induce la migración mediante la activación de integrina αvβ3; y finalmente (iv) determinar la contribución de TNC en las EVs de células de cáncer de mama a la formación de redes vasculares in vitro. Se establecieron las sublíneas| celulares con expresión reducida de TNC (MDA-MB-231 shTNC) y su control (MDA-MB-231 shLUC), a partir de la línea celular MDA-MB-231 WT. Luego, se aislaron y caracterizaron las EVs: se demostró que las EVs estaban enriquecidas en vesículas de <200 nm de diámetro y se demostró la presencia de marcadores proteicos de EVs. Además, se confirmó que el silenciamiento de TNC en las células MDA-MB-231 shTNC también redujo la incorporación de TNC en sus EVs. Para estudiar el efecto biológico de TNC en las EVs se evaluaron parámetros de migración e invasión de las células de cáncer de mama estimuladas con estas EVs. Se demostró que el pretratamiento de las células MDA-MB-231 WT con las EVs con TNC aumentó la migración, invasión y migración transendotelial de las mismas células, así como la migración e invasión de la línea celular de cáncer de mama no metastásico T-47D. El tratamiento usando las EVs con TNC aumentó la migración, pero no la invasión de las células MDA-MB-231. Análogamente, estos EVs aumentaron la migración de las células T-47D, mientras que todos los EVs, independiente del contenido de TNC, aumentaron la invasión de las células T-47D. A continuación, se estudió la captación de las EVs con un marcaje fluorescente en las células MDA-MB-231. La captación de las EVs durante una incubación de 24 h es alta (superior al 85%) y no depende de TNC contenida en las EVs. Por otra parte, el uso de inhibidores farmacológicos de integrinas tuvo efectos variables sobre la captación de las EVs: el anticuerpo bloqueante de integrina αvβ3 redujo la captación de las EVs, mientras que el péptido RGD no mostró efectos. Luego, se evaluó si TNC en las EVs podría inducir la migración celular a través de su interacción con integrina αvβ3. Se evidenció que el aumento de la migración celular causado por el tratamiento con las EVs con TNC requiere de la presencia de fibronectina. El uso de ambos inhibidores farmacológicos de integrinas previno el aumento de la migración de las células tratadas con las EVs que contienen TNC. En estos experimentos el péptido RGD fue mucho más eficiente, lo que sugiere que estaría bloqueando mecanismos adicionales dependientes de integrinas relevantes para la migracion en fibronectina y no relacionados con la captación de EVs. Se demostró también que TNC y CAV1 están localizadas en el lumen de las EVs, por lo que TNC contenida en las EVs no puede interactuar con integrina αvβ3 sin que haya un proceso previo de captación en la célula receptora. No se logró dilucidar el mecanismo por el cual las EVs con TNC aumentan la migración celular. Finalmente, el estudio del efecto proangiogénico de las EVs demostró que solamente las EVs con TNC aumentan la formación de redes vasculares en las células endoteliales. En conjunto, estos resultados respaldan el rol de TNC contenida en las EVs de células de cáncer de mama fomentando la adquisición de características promigratorias y angiogénicas en las células receptoras dependiente de la integrina αvβ3. Además, sugieren que la función de CAV1 es regular la incorporación de factores promotores del desarrollo del cáncer en las EVs.

Breast cancer is one of the types of cancer with the highest prevalence and mortality worldwide. The development of metastasis is responsible for 90% of deaths associated with this cancer and during this process, cancer cells acquire several biological characteristics, including increased migration/invasion and the ability to induce angiogenesis. Caveolin-1 (CAV1) is a protein that promotes migration, invasion and metastasis of breast cancer cells. Indeed, the highly metastatic human breast cancer cell line MDA-MB-231, expresses high levels of CAV1 and produces extracellular vesicles (EVs) containing CAV1. EVs are vesicular structures limited by a lipid bilayer that are released by cells and transfer bioactive molecules from one cell to another, modifying the behavior of recipient cells, thus contributing to cancer progression. EVs with CAV1 promote the migration and invasion of breast cancer cells in a manner dependent on the presence of CAV1. Also, proteins related to biological adhesion processes, including, but not limited to Tenascin C (TNC), were shown to co-seggregate with CAV1 in the EVs of MDA-MB-231 cells. TNC reportedly increases cancer cell migration and promotes pro-angiogennic features in endothelial cells. Interestingly, TNC function has been suggested to promote cell motility by activating integrin αvβ3. Integrins are cellular receptors that mediate adhesion to the extracellular matrix, regulate cell migration and angiogenesis. It has been reported that αvβ3 integrin positively regulates the uptake of EVs by MDA-MB-231 cells. Activation of αvβ3 integrin can be inhibited using peptides containing the RGD motif or blocking antibodies. To date it remains unknown whether TNC contained in EVs of MDA-MB-231 cells is responsible for the increased migration and invasion of breast cancer cells or whether it promotes angiogenesis of endothelial cells. Moreover, whether the uptake of EVs can be inhibited pharmacologically by blocking integrin αvβ3 is also unknown. To answer these questions, we propose the following hypothesis: Extracellular vesicles from breast cancer cells that contain CAV1 and TNC increase cancer cell migration and invasion through αvβ3 integrin-dependent vesicle uptake and promote the formation of vascular networks by endothelial cells. To address the hypothesis, the following specific objectives were defined: (i) to determine the effect of TNC contained in the EVs from breast cancer cells expressing CAV1 on the migration, invasion and transendothelial migration of breast cancer cells; (ii) to study whether EV uptake depends on the TNC contained in EVs and on αvβ3 integrin in breast cancer cells; (iii) to evaluate whether TNC contained in the EVs of breast cancer cells increases migration of recipient cells by activating the integrin αvβ3; and finally (iv) to determine the contribution of TNC in EVs to the formation of vascular networks by endothelial cells in vitro. Cell sublines with reduced expression of TNC (MDA-MB-231 shTNC) or not (control MDA-MB-231 shLUC) were generated from the MDA-MB-231 WT cell line. Then, we proceeded to isolate and characterize the EVs produced by these cell lines. EVs were shown to be enriched in vesicles <200 nm in diameter and the presence of protein markers characteristic of EVs was observed. Furthermore, we confirmed that silencing of TNC in MDA-MB-231 shTNC cells also reduced incorporation of TNC into EVs. To study the biological effects of TNC in EVs, their ability to promote migration and invasion in recipient cells was evaluated. Pre-treatment of MDA-MB-231 WT cells with the EVs containing TNC increased the migration, invasion and transendothelial migration of the same cells, as well as migration and invasion of the non-metastatic breast cancer cell line T-47D. Treatment with TNC-containing EVs increased migration, but not the invasion of MDA-MB-231. Analogously, these EVs increased the migration of T-47D cells, while all EVs independent of the TNC content, increased invasion of T-47D cells. Next, the uptake of fluorescently labeled EVs by MDA-MB-231 cells was studied. EV uptake after incubation for 24 h was high (greater than 85 %) and did not depend on the presence of TNC in the EVs. On the other hand, the use of pharmacological inhibitors of integrins had varying effects on EV uptake. The αvβ3 integrin blocking antibody reduced EVs uptake, while the RGD peptide had no effect. Then, we evaluated whether the ability of TNC in EVs to induce cell migration depended on interaction with the integrin αvβ3. We observed that the increase in cell migration observed following treatment with EVs containing TNC required the presence of fibronectin. The application of either the antibody or peptide inhibitor prevented the increase in cell migration observed following treatment with EVs containing TNC. In these experiments, the RGD peptide inhibitor was much more efficient, suggesting that it was blocking additional integrin-dependent mechanisms relevant to migration on fibronectin not related to EV uptake. Also, TNC and CAV1 were found to be localized in the lumen of EVs, suggesting that TNC contained in EVs does not interact directly with αvβ3 integrin, but rather requires prior EV uptake by recipient cells. Unfortunately, we were unable to elucidate the precise mechanism by which EVs containing TNC increase migration in recipient cells. Finally, only EVs containing TNC increased the formation of vascular networks by endothelial cells. Taken together, these results support the notion that TNC contained in EVs of metastatic breast cancer cells promotes the migration and invasion of recipient cancer cells via the integrin αvβ3 and angiogenesis of endothelial cells, although in the latter case the relevance of the integrin αvβ3 remains to be defined. Moreover, these results suggest that the function of CAV1 in EV biogenesis in metastatic cancer cells is to regulate the incorporation of cancer-promoting components into EVs.