Estradiol en la patogénesis de la hipertensión pulmonar arterial (HPA) : rol de la actividad estrogénica y del metabolismo hormonal sobre células de la musculatura arterial lisa

Abstract

Antecedentes: La hipertensión pulmonar (HP) es una enfermedad crónica, progresiva y actualmente incurable. Esta puede ser clasificada según su etiología y área pulmonar afectada. Para nuestro interés consideramos la HP arterial idiopática (HPAi), pues es una enfermedad que actualmente solo posee tratamientos paliativos y se desconoce su origen. La HPAi se caracteriza por un aumento de la presión sanguínea de la arteria pulmonar. Dicha presión está regulada principalmente por las células de la capa muscular lisa (PASMCs). Al presentarse la patología, se describe que las PASMCs sufren un cambio fenotípico “tipo canceroso” que conlleva a una proliferación sostenida que causa disminución del lumen de la arteria, aumentando la presión. Cuando este proceso es sostenido en el tiempo, se produce insuficiencia ventricular derecha, la cual puede ser mortal. Adicionalmente, estas células presentan disfunción mitocondrial. Esta disfunción se manifiesta por un cambio metabólico desde la obtención de energía por fosforilación oxidativa hacia un metabolismo preferentemente glicolítico, asociado a un aumento de la fisión mitocondrial mediada por la proteína de fisión mitocondrial DRP1. Este fenotipo se correlaciona con menor consumo de oxígeno y menor potencial mitocondrial. Entre los mayores factores de riesgo para sufrir HPAi encontramos niveles aumentados de estradiol (E2) plasmático y presentar sexo femenino. Cuando se comparan hombres y mujeres, las últimas poseen mayor tiempo de supervivencia gracias al factor protector cardiovascular del estrógeno. Este fenómeno es denominado “la paradoja del estrógeno”. Existe evidencia de acción mitogénica de E2 en PASMCs. Así también, en los últimos años se ha descrito que el E2 puede ser metabolizado y sus metabolitos también ejercen respuestas biológicas. De nuestra atención son los metoxiestrógenos, considerados dentro de los principales metabolitos del E2. En esta clasificación destacamos al 2-metoxiestradiol (2-ME) y al 4-metoxiestradiol (4-ME). El 2-ME ha mostrado reducir la HP en modelos in vivo. Sin embargo, se desconoce el efecto sobre las PASMCs del 4-ME. Adicionalmente, los efectos de los estrógenos son ejercidos mediante los llamados receptores de estrógeno (ERα y ERβ y GPER), indicándonos que el probable fenotipo “canceroso” o “hipertenso” que se desencadena en las PASMCs, el cual es inducido por los estrógenos, puede estar asociado a procesos de señalización celular y a la transcripción génica gatillada por la activación de estos receptores. Hipótesis de trabajo: 17 β-estradiol y su metabolito 4-metoxiestradiol, inducen proliferación de las hPASMCs a través de un mecanismo dependiente de la inhibición de la función mitocondrial y de las vías de receptores de estrógenos clásicas y no clásicas, reflejando el fenotipo patológico encontrado en pacientes hipertensos pulmonares arteriales idiopáticos. Objetivos específicos: 1) Evaluar el efecto del 17 β-estradiol y su metabolito 4-metoxiestradiol en la proliferación de hPASMCs. 2) Determinar el efecto del 17 β-estradiol y su metabolito 4-metoxiestradiol en la función mitocondrial. 3) Evaluar la participación de los receptores ERα, ERβ y GPER en los efectos sobre hPASMC inducido por 17 β-estradiol y 4-Metoxiestradiol. 4) Analizar redes de regulación transcripcional asociadas al metabolismo energético y hormonal que se encuentren controladas por nodos estrogénicos en bases de datos transcripcionales de tejido pulmonar provenientes de pacientes HPAi. Diseño experimental: Modelo in vitro: Se utilizaron hPASMCs tratadas con E2 (0-100 nM) por 24 y 48 horas. Se evaluó proliferación celular mediante ensayo MTS, análisis de ciclo celular por ioduro de propidio (IP), proliferación y viabilidad mediante exclusión por azul tripán, viabilidad celular utilizando IP y anexina V y proliferación celular mediante inmunodetección de Ki67. Así también, se analizó la producción de especies reactivas de oxígeno mitocondriales (mtROS) utilizando MitoSOX, potencial mitocondrial mediante safranina y consumo de oxígeno mediante respirometría de alta resolución. Análisis de los receptores de estrógenos: hPASMCs se pretrataron con los inhibidores Fulvestrant o G36 durante 3 horas para luego estimular con E2 100 nM o 4-ME 10 nM por 48 horas. Se evaluó proliferación celular relativa mediante MTS y conteo celular por exclusión de azul tripán. Modelo in silico: Bases de datos de expresión génica provenientes de publicaciones indexadas reportando pacientes de HPAi se filtraron por sexo y edad, se emparejaron y analizaron utilizando el programa Cytoscape. Resultados: I) E2 (10 nM y 100 nM) y 4-ME (5 nM y 10 nM) aumentan significativamente la proliferación celular de hPASMCs. II) E2 (10 nM) y 4-ME (5 y 10 nM) aumentó significativamente mtROS en hPASMCs. III) El tratamiento con E2 (10 nM y 100 nM) y 4-ME (5 nM y 10 nM) disminuyó el potencial mitocondrial en hPASMCs. IV) Los tratamientos con estrógenos alteraron la respiración mitocondrial de manera significativa en hPASMCs. V) La proliferación de hPASMCs inducida por E2 100 nM es mediada por ERα y/o ERβ (vía clásica). VI) La proliferación de hPASMCs inducida por 4-ME 10 nM es mediada por GPER (vía no clásica). VII) En HPAi, las redes transcripcionales están gobernadas principalmente por vías asociadas a receptores de estrógenos y su metabolismo, generando una disrupción en el equilibrio metabólico. Conclusiones: Las vías estrogénicas son reguladores maestros en la reprogramación transcripcional de la HPAi. E2 y 4-ME inducen la proliferación de hPASMCs, aumentando la producción de mtROS y disminuyendo el potencial mitocondrial. Los estrógenos afectan significativamente la tasa de consumo de oxígeno mitocondrial. La proliferación inducida por estrógenos difiere en los receptores utilizados, siendo el efecto de E2 mediado por la vía clásica y el 4-ME por la vía no clásica.

Background: Pulmonary hypertension (PH) is a chronic, progressive, and currently incurable disease. It can be classified according to its etiology and affected lung area. Idiopathic arterial PH (iPAH) is our interest, since it is a disease that currently only has palliative treatments, and an unknown origin. HPAi is characterized by an increase in pulmonary artery blood pressure. Said pressure is regulated mainly by the pulmonary artery smooth muscle layer cells (PASMCs). When the pathology occurs, the PASMCs undergo a "cancerous type" phenotypic change that leads to a sustained proliferation that causes a decrease in the lumen of the artery, increasing the pressure. When this process is sustained over time, right ventricular failure occurs, which can be fatal. Additionally, these cells present mitochondrial dysfunction. This dysfunction is manifested by a metabolic change from obtaining energy by oxidative phosphorylation towards a preferentially glycolytic metabolism, associated with an increase in DRP1-mediated mitochondrial fission. This phenotype is correlated with lower oxygen consumption and lower mitochondrial potential. Among the major risk factors for HPAi are increased levels of plasma estradiol (E2) and being female. When men and women are compared, the latter have a longer survival time thanks to the cardiovascular protective factor of estrogen. This phenomenon is called "the estrogen paradox". There is evidence of mitogenic action of E2 in PASMCs. Likewise, in recent years it has been described that E2 can be metabolized, and its metabolites also exert biological responses. Of our attention are methoxyestrogens, considered among the main metabolites of E2. In this classification we highlight 2-methoxyestradiol (2-ME) and 4-methoxyestradiol (4-ME). 2-ME has been shown to reduce HP in in vivo models. However, the effect on PASMCs of 4-ME is unknown. Additionally, the effects of estrogens are exerted through the so-called estrogen receptors (ERα and ERβ and GPER), indicating that the probable "cancer" or "hypertensive" phenotype that is triggered in PASMCs, which is induced by estrogens, it may be associated with cell signaling processes and gene transcription triggered by the activation of these receptors. Hypothesis: 17β-estradiol and its metabolite 4-methoxyestradiol induce proliferation of hPASMCs through a mechanism dependent on the inhibition of mitochondrial function and the classical and non-classical estrogen receptor pathways, reflecting the pathological phenotype found in Idiopathic pulmonary arterial hypertensives patients. Specific objectives:1) To evaluate the effect of 17β-estradiol and its metabolite 4-methoxyestradiol on the generation of hPASMCs. 2) Determine the effect of 17β-estradiol and its metabolite 4-methoxyestradiol on mitochondrial function. 3) To evaluate the participation of the ERα, ERβ and GPER receptors in the effects on hPASMC induced by 17β-estradiol and 4-methoxyestradiol. 4) Analyze transcriptional regulation networks associated with energy and hormonal metabolism that are controlled by estrogen nodes in transcriptional databases of lung tissue from HPAi patients. Experimental Design: In vitro model: hPASMCs treated with E2 (0-100 nM) for 24 and 48 hours were used. Cell proliferation was evaluated by MTS assay, cell cycle analysis by propidium iodide (IP), proliferation and viability by trypan blue exclusion, cell viability using IP and annexin V, and cell proliferation by Ki67 immunodetection. Likewise, the production of mitochondrial reactive oxygen species (mtROS) was analyzed using MitoSOX, mitochondrial potential using safranin and oxygen consumption using high-resolution respirometry. Estrogen receptor analysis: hPASMCs were pretreated with the inhibitors Fulvestrant or G36 for 3 hours and then stimulated with 100 nM E2 or 10 nM 4-ME for 48 hours. Relative cell proliferation was assessed by MTS and cell count by trypan blue exclusion. In silico model: Gene expression databases from indexed publications reporting HPAi patients were filtered by sex and age, matched, and analyzed using the Cytoscape program. Results: I) E2 (10 nM and 100 nM) and 4-ME (5 nM and 10 nM) significantly increased cell proliferation of hPASMCs. II) E2 (10 nM) and 4-ME (5 and 10 nM) significantly increased mtROS in hPASMCs. III) Treatment with E2 (10 nM and 100 nM) and 4-ME (5 nM and 10 nM) decreased mitochondrial potential in hPASMCs. IV) Estrogen treatments altered mitochondrial respiration significantly in hPASMCs. V) hPASMCs proliferation induced by 100 nM E2 is mediated by ERα and/or ERβ (classical pathway). VI) hPASMCs proliferation induced by 4-ME 10 nM is mediated by GPER (non-classical pathway). VII) In HPAi, the transcriptional networks are mainly governed by pathways associated with estrogen receptors and their metabolism, generating a disruption in the metabolic balance. Conclusions: Estrogenic pathways are master regulators in HPAi transcriptional reprogramming. E2 and 4-ME induce the proliferation of hPASMCs, increasing the production of mtROS and decreasing the mitochondrial potential. Estrogens significantly affect the rate of mitochondrial oxygen consumption. Estrogen-induced proliferation differs in the receptors used, being the effect of E2 mediated through the classical pathway and 4-ME through the non-classical pathway.