Influencia de la progesterona en la expresión de conexina 37 (cx37) durante la maduración in vitro de ovocitos de perra

Abstract

A nivel reproductivo la hembra canina presenta características particulares como el significativo aumento de los niveles plasmáticos de progesterona (P4) antes de la ovulación, debido a una luteinización preovulatoria de los folículos, y además, la ovulación de ovocitos detenidos aún en la profase de la primera división meiótica, alcanzando el estado de segunda metafase (MII) en el oviducto. Estos diferentes ambientes en la maduración del ovocito canino y los eventos asociados, ha presentado un problema en imitarlos para el desarrollo de protocolos de cultivo in vitro. Las altas concentraciones de P4 en la ovulación podrían tener una participación en este proceso. Por otra parte, se ha descrito que existen cambios significativos en el nivel de la expresión génica de la Cx37, presente en las uniones comunicantes entre las células del COC previo y posterior a la ovulación, por lo que el objetivo de este estudio fue conocer si las concentraciones altas de P4 estarían en concomitancia con la disminución de expresión del gen de Cx37 en los complejos cúmulo ovocitos caninos, como también su influencia sobre el desarrollo meiótico in vitro de estos. Se utilizaron 900 COCs caninos, provenientes de folículos antrales obtenidos de ovarios de 60 perras de diferentes etapas del ciclo estral. Los ovocitos se maduraron in vitro en un medio base TCM suplementando con diferentes concentraciones de progesterona 1) 0 P4 o control; 2) 50 μg/mL P4 y 3) 100 μg/mL P4). Después del cultivo se evaluó el desarrollo de los ovocitos de cada grupo, donde la clasificación del estado de desarrollo meiótico se realizó con un microscopio de epifluorescencia invertida, clasificando a los ovocitos en estados de: VG, VGBD, MI y MII. En ovocitos de los mismos grupos de maduración se les evaluó la expresión relativa del gen de Cx37 mediante RT-qPCR. Los resultados del desarrollo meiótico y de la expresión relativa del gen se evaluaron mediante ANOVA y Post test de Duncan. La adición de P4 resultó en un mayor (P <0,05) número de ovocitos que reanudaron la meiosis y mayor proporción de ovocitos que alcanzaron la etapa de MII (P <0,05). La expresión relativa del gen de Cx37 mostró una disminución (P <0,05) en los ovocitos madurados in vitro en relación con los que no se sometieron a maduración, pero sin diferencias significativas entre las concentraciones de P4. Estos resultados sugieren que la P4 estaría involucrada en la maduración meiótica de los ovocitos, pero no mediante la disminución de la expresión génica de la Cx37

Canine females present reproductive characteristics such as increased progesterone concentrations (P4) before ovulation due to pre-ovulatory luteinization of the follicles, ovulation of oocytes in the prophase of the first meiotic division, reaching the second metaphase (MII) stage in the oviduct. The different environments during the oocyte maturation in vivo make it difficult to mimic these conditions for in vitro maturation (IVM); therefore, the current IVM systems are far from optimal in terms of the percentage of mature oocytes obtained. The high P4 concentrations during the periovulatory period might play a role in oocyte maturation. On the other hand, it has been described that there are significant changes in the gene expression of Cx37 in this periovulatory period. Thus, this study aimed to know if the high P4 concentrations influence the nuclear maturation of canine oocytes matured in culture and if this influence was related to the expression of Cx37. The experimental protocol included 900 canine COCs from antral follicles obtained from 60 bitches at different estrous cycle stages. Oocytes were IVM in TCM base medium supplemented with different concentrations of progesterone 1) 0 P4 or control; 2) 50 μg/mL P4 and 3) 100 μg/mL P4). After culture, the oocytes of each group were evaluated for nuclear development, where the classification of the meiotic developmental stage was assessed with an inverted epifluorescence microscope. The nuclear development was classified into VG, VGBD, MI, and MII stages. Oocytes from the same maturation groups were evaluated for relative expression of the Cx37 gene by RT-qPCR. ANOVA and Duncan's Post-test evaluated the meiotic development and relative gene expression. Addition of P4 resulted in a higher (P <0.05) number of oocytes resumed meiosis and a higher proportion of oocytes reached the MII stage (P <0.05). Relative Cx37 gene expression showed a decrease (P <0.05) in oocytes matured in vitro compared to those that did not undergo maturation; however, there were no differences in the expression of the Cx37 gene in the progesterone-added groups. These results suggest that P4 would be involved in the meiotic maturation of canine oocytes but not in Cx37 gene expression during IVM