Efecto de resolvina D1 sobre la secreción de citoquinas y colágeno en miofibroblastos cardíacos senescentes inducidos por TGF-β1

Abstract

El envejecimiento es uno de los factores más preponderantes para el desarrollo de enfermedades cardiovasculares (ECV). Uno de los sellos característicos del envejecimiento es la senescencia celular. Este fenotipo se caracteriza por un arresto irreversible del ciclo celular, junto con alteraciones funcionales y la adquisición del fenotipo secretor asociado a senescencia (SASP). Este secretoma es de carácter pro-inflamatorio y pro-remodelado tisular; lo que afecta profundamente la estructura y funcionalidad del tejido cardíaco; más aún, diversa evidencia relaciona directamente la presencia de células senescentes en múltiples patologías cardiovasculares. El fibroblasto cardíaco (FC) es descrito como una célula centinela del tejido cardíaco, y se encarga de coordinar las respuestas reparativas tras una lesión. Esta función debe ser muy regulada, y si esto no ocurre se desencadena la fibrosis cardíaca, caracterizada por un excesivo depósito de proteínas de la matriz extracelular (ECM), produciendo rigidez y disfunción cardíaca. En este sentido, el FC entra en el proceso de diferenciación, donde adquiere el fenotipo de miofibroblasto cardíaco (MFC), tipo celular con altas propiedades secretoras de proteínas de la ECM y este proceso de diferenciación se induce en contextos patológicos como infarto al miocardio o hipertensión arterial. A pesar de su alta capacidad secretora, la evidencia en este tópico muestra que la senescencia prematura de los MFC es beneficiosa en un escenario agudo de daño cardíaco, debido a que los MFC senescentes limitan la fibrosis exacerbada tras la lesión cardíaca. No obstante, en un escenario crónico este fenotipo se vuelve dañino para el tejido, puesto que promueve la fibrosis a través del SASP. Íntimamente ligado con lo anterior, el factor de crecimiento transformante β1 (TGF-β1) juega un rol crucial en promover la diferenciación del FC a MFC, además que se le considera el regulador maestro del desarrollo de fibrosis cardíaca. En adición a lo anterior, se le ha atribuido la capacidad de producir senescencia en múltiples tipos celulares, a través de la activación de múltiples vías de señalización que conllevan al arresto del ciclo celular, producción del SASP y secreción de proteínas de la ECM. Dado el rol central de los MFC en el desarrollo de la fibrosis, es atractivo investigar si efectivamente el proceso de diferenciación desde FC a MFC inducido por TGF-β1 es paralelo a la inducción de senescencia y, además, evaluar alternativas farmacológicas que pudieran atenuar o reducir la secreción del SASP y proteínas de la ECM por parte de los MFC senescentes. Respecto a lo anterior, las investigaciones se centran en fármacos que puedan eliminar células senescentes (senolíticos), y aquellos que puedan modificar la composición del SASP o atenuar la secreción de éste (senostáticos). Resultados previos de nuestro laboratorio muestran que Resolvina D1 (RvD1), un mediador lipídico resolutor de la inflamación derivado del ácido docosahexaenoico (DHA), atenúa la fibrosis inducida por Angiotensina II en ratones, además de disminuir la inflamación producida por LPS y Angiotensina II en FC. No obstante, no hay evidencia en la literatura sobre efectos de RvD1 en MFC senescentes, por lo que su uso resulta idea atractiva, considerando la falta de terapias para atenuar la fibrosis cardíaca y la inflamación, característica común de las ECV. Tomando en cuenta los antecedentes, se formuló siguiente hipótesis: Resolvina D1 reduce la secreción de citoquinas y colágeno en miofibroblastos cardíacos senescentes inducidos por TGF-β1. Para poder dar respuesta a la hipótesis, se plantearon los siguientes objetivos: 1. Determinar si la diferenciación de fibroblastos a miofibroblastos inducida por TGF-β1 es paralela a la inducción de senescencia celular. 2. Caracterizar el perfil de secreción de citoquinas y colágeno por parte de un miofibroblasto cardíaco senescente inducido por TGF-β1. 3. Examinar si Resolvina D1 reduce la secreción del SASP y colágeno en los miofibroblastos cardíacos senescentes, comportándose como un senostático. El modelo experimental se desarrolló con FC de rata neonata Sprague-Dawley tratados con TGF- β1 (10 ng/mL) por 7 días en FBS 10%. Luego de los tiempos experimentales, se determinaron los niveles proteicos por WB de diversos marcadores de senescencia y proteínas asociadas a inflamación como p16, p21, p-Rb, Bax, Bcl-xl y VCAM-1, se evaluó la actividad SA-β-gal, también se realizó IF para γ-H2AX, KI-67 y α-SMA, además de medir la secreción de colágeno mediante precipitación con Sirius Red y la secreción de citoquinas a través de LUMINEX. Los resultados de este trabajo son los siguientes: • El proceso de diferenciación de FC a MFC es paralelo a la inducción de senescencia, evidenciado por el aumento de los marcadores p15-p16, p21, SA-β-gal, disminución de la tinción con KI-67 y disminución de la fosforilación de Rb. • Los MFC senescentes secretan mayores niveles de IL-1β, IL-6, IL-5 e IL-10, junto con secretar niveles muy bajos de TNF-α, indicando que su perfil secretor es de bajo grado inflamatorio. Los MFC senescentes secretan mayores niveles de colágeno, por lo que podrían contribuir a la cicatrización en caso de alguna lesión cardíaca, pero su persistencia en el tejido podría promover el desarrollo de fibrosis. También expresan mayores niveles de VCAM-1, pudiendo incidir en la adhesión de células del sistema inmune. • Los MFC son células senescentes puesto que al añadirle nuevamente FBS 10%, los niveles bajos de fosforilación de Rb persisten. • Resolvina D1 no modifica el perfil de secreción de las citoquinas evaluadas, pero disminuye la secreción de colágeno y los niveles de VCAM-1 a dosis de 100 nM. Estos resultados nos permiten concluir que los MFC senescentes son células senescentes, secretoras de colágeno y con un SASP de bajo grado inflamatorio, y que RvD1 atenúa algunas características de los MFC senescentes como la secreción de colágeno y la expresión de VCAM-1, no obstante, a la dosis utilizada, no se observaron reducciones en la secreción de citoquinas. Poder determinar rangos de dosis óptimos para reducir la inflamación, y también, los mecanismos moleculares asociados se convierten en un interesante tópico para investigar.

Aging is one of the most significant factors for the development of cardiovascular diseases (CVD). One of the hallmark characteristics of aging is cellular senescence. This phenotype is characterized by irreversible cell cycle arrest, along with functional alterations and the acquisition of the senescence-associated secretory phenotype (SASP). This secretome is pro-inflammatory and pro-tissue remodeling, profoundly affecting the structure and functionality of cardiac tissue. Moreover, various evidence directly links the presence of senescent cells with multiple cardiovascular pathologies. The cardiac fibroblast (CF) is described as a sentinel cell of the cardiac tissue, responsible for coordinating reparative responses after injury. This function must be tightly regulated; if not, cardiac fibrosis ensues, characterized by excessive deposition of extracellular matrix (ECM) proteins, leading to stiffness and cardiac dysfunction. In this context, the CF undergoes differentiation, acquiring the cardiac myofibroblast (CMF) phenotype, a cell type with high ECM protein secretion properties. This differentiation process is induced in pathological contexts such as myocardial infarction or hypertension. Despite its high secretory capacity, evidence suggests that premature senescence of CMFs is beneficial in an acute cardiac damage scenario because senescent CMFs limit exacerbated fibrosis post-cardiac injury. However, in a chronic scenario, this phenotype becomes harmful to the tissue, promoting fibrosis through the SASP. Closely related to the above, transforming growth factor β1 (TGF-β1) plays a crucial role in promoting CF to CMF differentiation and is considered the master regulator of cardiac fibrosis development. Additionally, it has been attributed with the ability to induce senescence in multiple cell types by activating various signaling pathways that lead to cell cycle arrest, SASP production, and ECM protein secretion. Given the central role of CMFs in fibrosis development, it is appealing to investigate whether the differentiation process from CF to CMF induced by TGF-β1 parallels the induction of senescence and to evaluate pharmacological alternatives that could attenuate or reduce the secretion of SASP and ECM proteins by senescent CMFs. Research in this area focuses on drugs that can eliminate senescent cells (senolytics) and those that can modify the SASP composition or attenuate its secretion (senostatics). Previous results from our laboratory show that Resolvin D1 (RvD1), a lipid mediator derived from docosahexaenoic acid (DHA) that resolves inflammation, attenuates Angiotensin II-induced fibrosis in mice and reduces inflammation caused by LPS and Angiotensin II in CFs. However, there is no evidence in the literature about the effects of RvD1 on senescent CMFs, making its use an attractive idea considering the lack of therapies to attenuate cardiac fibrosis and inflammation, common characteristics of CVDs. Considering the background, the following hypothesis was formulated: Resolvin D1 reduces the secretion of cytokines and collagen in senescent cardiac myofibroblasts induced by TGF-β1. To address the hypothesis, the following objectives were proposed: 1. Determine whether TGF-β1-induced fibroblast to myofibroblast differentiation parallels cellular senescence induction. 2. Characterize the cytokine secretion and collagen profile of a senescent cardiac myofibroblast induced by TGF-β1. 3. Examine if Resolvin D1 reduces the secretion of cytokines and collagen in senescent cardiac myofibroblasts, acting as a senostatic. The experimental model was developed with neonatal rat Sprague-Dawley CFs treated with TGF-β1 (10 ng/mL) for 7 days in 10% FBS. After the experimental periods, protein levels of various senescence markers and inflammation-associated proteins such as p16, p21, p-Rb, Bax, Bcl-xl, and VCAM-1 were determined by WB, SA-β-gal activity was evaluated, IF was performed for γ-H2AX, KI-67, and α-SMA, and collagen secretion was measured by Sirius Red precipitation and cytokine secretion by LUMINEX. The results of this work are as follows: • The differentiation process from CF to CMF parallels senescence induction, evidenced by increased p15-p16, p21, SA-β-gal markers, decreased KI-67 staining, and reduced Rb phosphorylation. • Senescent CMFs secrete higher levels of IL-1β, IL-6, IL-5, and IL-10, along with very low levels of TNF-α, indicating a low-grade inflammatory secretory profile. • Senescent CMFs secrete higher levels of collagen, potentially contributing to cardiac injury healing, but their persistence in the tissue could promote fibrosis development. They also express higher levels of VCAM-1, possibly influencing immune cell adhesion. CMFs are senescent cells since the low phosphorylation levels of Rb persist when 10% FBS is added again. • Resolvin D1 does not modify the secretion profile of the evaluated cytokines but reduces collagen secretion and VCAM-1 levels at 100 nM doses. These results allow us to conclude that senescent CMFs are senescent cells, collagen secretors with a low-grade inflammatory SASP, and that RvD1 attenuates some characteristics of senescent CMFs such as collagen secretion and VCAM-1 expression. However, at the utilized dose, reductions in cytokine secretion were not observed. Determining optimal dose ranges to reduce inflammation and the associated molecular mechanisms becomes an interesting topic for further investigation.