Efecto diferencial del ácido graso saturado palmitato y del insaturado oleato sobre la morfología e interacción gota lipídica-mitocondria y la función oxidativa mitocondrial en células hepáticas hepg2

Abstract

Introducción: La esteatosis hepática se caracteriza por la acumulación de triglicéridos en organelos especializados llamados gotas lipídicas (LDs). La sobrecarga de ácidos grasos ya sean saturados como el ácido palmítico (PA) o insaturados como el ácido oleico (OA) produce esteatosis. Sin embargo, solo el tratamiento con PA provoca daños en el hígado asociado a disfunción mitocondrial. En la actualidad, se desconoce si estos resultados están relacionados a un efecto diferencial entre PA y OA en la dinámica e interacción entre las LDs y mitocondrias. Objetivo: Evaluar el efecto de una sobrecarga lipídica a través del tratamiento de PA o OA en la morfología e interacción física entre LD-mitocondria y en la bioenergética mitocondrial en células HepG2. Métodos: Los hepatocitos de la línea HepG2 fueron expuestos por 2, 6, 18 y 24 h a PA 200 μM o OA 200 μM conjugado a albumina de suero bovino (BSA). BSA fue utilizado como control. Las células fueron incubadas con BODIPY 493/503 y MitoTracker Orange para la tinción de LDs y de mitocondrias, respectivamente. Se analizó el número, volumen y colocalización de las LDs y mitocondrias por medio de imágenes obtenidas por microscopia confocal, las que luego fueron cuantificadas con el software ImageJ, NIH. Los niveles de proteína de PLIN2, PLIN5 y Mfn2 se evaluaron mediante Western Blot. La función oxidativa mitocondrial se determinó a través de las mediciones de potencial de membrana mitocondrial, consumo de oxígeno y niveles de ATP. Resultados: La sobrecarga de OA promueve una mayor acumulación en el número y tamaño de LDs comparado con PA. La evaluación del consumo de oxígeno reveló que ambos tratamientos estimularon la respiración mitocondrial. Sin embargo, OA promovió una acumulación general del potencial mitocondrial mientras que PA favoreció la fragmentación mitocondrial, concomitante con un metabolismo orientado hacia la generación de ATP. En relación con la colocalización LD-mitocondria, si bien PA indujo menor proximidad entre los organelos, las LDs se asociaron a subgrupo de mitocondrias altamente activas, sugiriendo que su interacción media la oxidación de ácidos grasos y la síntesis de ATP. Por el contrario, la sobrecarga de OA parece estimular la interacción LD-mitocondrias principalmente para el crecimiento de estas últimas. Conclusión: Las diferencias observadas indican que OA se acumula fácilmente en las LDs, lo que probablemente reduce su toxicidad, mientras que el PA estimula preferentemente el metabolismo oxidativo mitocondrial, lo que puede contribuir a la progresión del daño hepático.

Background: Fatty liver disease is characterized by the accumulation of triglycerides into specialized organelles called lipid droplets (LDs). Fatty acid overload, either of the saturated palmitic acid (PA) or the unsaturated oleic acid (OA) produces steatosis. However, only PA overload leads to liver damage mediated by mitochondrial dysfunction. To date, it is unknown if these divergent outcomes are related to a differential effect between PA and OA on the dynamics and interaction between LDs and mitochondria. Objectives: To evaluate the effect of lipid overload by the treatment of PA or OA on the LD morphology, their physical interaction with mitochondria, and mitochondrial bioenergetics in HepG2 cells. Methods: HepG2 cells were exposed for 2, 6, 18, and 24 h to 200 μM PA or 200 μM OA conjugated to bovine serum albumin (BSA), BSA was used as control. LD number, volume, and colocalization with mitochondria were measured in cells incubated with BODIPY 493/503 and MitoTracker Orange for LD and mitochondria staining, respectively. HepG2 cells were later fixed and mounted for imaging by Confocal microscopy and then analyzed using the ImageJ software, NIH. Western blot was used to evaluate protein levels of PLIN2, PLIN5, and Mfn2. The mitochondrial oxidative function was assessed in terms of the mitochondrial membrane potential, the oxygen consumption rate (OCR), and ATP levels. Results: OA overload promotes more and bigger LD accumulation than PA. OCR indicated that both treatments stimulated mitochondrial respiration; however, OA favored an overall build-up of the mitochondrial potential, while PA evoked a mitochondrial fragmentation, concomitant with an ATP-oriented metabolism. Even though PA-induced a lesser increase in LDmitochondria proximity than OA, those LD associated with highly active mitochondria suggesting that they interact mainly to fuel fatty acid oxidation and ATP synthesis. On the contrary, OA overload seemingly stimulated LD-mitochondria interaction mainly for LD growth. Conclusion: In sum, these differences point out that OA readily accumulates in LD, likely reducing their toxicity, while PA preferably stimulates mitochondrial oxidative metabolism, which may contribute to liver damage progression.