Construcción de plasmidios recombinantes para la expresión, purificación y evaluación de la actividad proteolítica in vitro del efector GtgE de Salmonella typhimurium sobre la proteína Rab32A de Dictyostelium discoideum

Abstract

GtgE es un efector proteico translocado por los sistemas de secreción de tipo III codificados en las islas de patogenicidad SPI-1 y SPI-2 de Salmonella. Este efector presenta actividad cisteína proteasa contra GTPasas monoméricas como Rab32 en células de mamífero. Rab32 es crucial para restringir el crecimiento de bacterias patógenas intracelulares y es reclutada hacia la “vacuola contenedora de Salmonella” (SCV), compartimiento donde la bacteria sobrevive dentro de la célula hospedera. La proteólisis de Rab32 por GtgE interfiere en su reclutamiento hacia la SCV, promoviendo la supervivencia intracelular de Salmonella en macrófagos. Recientemente, nuestro grupo de investigación demostró que Salmonella Typhimurium necesita a GtgE para sobrevivir intracelularmente en un compartimiento similar a la SCV en la ameba Dictyostelium discoideum. Análisis bioinformáticos revelaron que el genoma de esta ameba codifica 4 proteínas Rab32 (Rab32A–D), las que poseen alta similitud aminoacídica con Rab32 de mamíferos y presentan la secuencia blanco reconocida por GtgE. Ensayos de expresión heteróloga en Escherichia coli indicaron que GtgE proteoliza a Rab32A, la única Rab32 de D. discoideum cuya expresión se ha comprobado experimentalmente. En esta investigación, se generaron construcciones plasmidiales con el fin de expresar y purificar la GTPasa Rab32A de D. discoideum, el efector GtgE de S. Typhimurium y una variante de este efector sin actividad catalítica (GtgEH151A). Las tres proteínas de interés se obtuvieron como proteínas de fusión al epítopo 6xHis en una cepa comercial de E. coli. La expresión inducible y la producción soluble de cada proteína se evaluó mediante SDS-PAGE y Western blot. Posteriormente, las proteínas fueron purificadas mediante cromatografía de afinidad usando una resina de ácido nitrilotriacético cargada de níquel (Ni-NTA) y sus identidades fueron confirmadas mediante SDS-PAGE y Western blot. De esta forma, se obtuvieron fracciones altamente enriquecidas de los efectores GtgE y GtgEH151A, así como del blanco molecular Rab32A. Finalmente, se realizaron ensayos enzimáticos in vitro utilizando las proteínas purificadas para evaluar la actividad proteolítica de GtgE sobre Rab32A, analizando los productos de reacción mediante SDS-PAGE. Estos experimentos confirmaron la actividad proteolítica in vitro del efector GtgE de S. Typhimurium sobre la GTPasa monomérica Rab32A de D. discoideum.

GtgE is an effector translocated by the type III secretion systems encoded in the SPI-1 and SPI-2 pathogenicity islands of Salmonella. This effector exhibits cysteine protease activity against monomeric GTPases such as Rab32 in mammalian cells. Rab32 is crucial for restricting the growth of intracellular pathogenic bacteria and is recruited to the “Salmonellacontaining vacuole” (SCV), the compartment where the bacteria survive inside the host cell. The proteolysis of Rab32 by GtgE interferes with its recruitment to the SCV, promoting the intracellular survival of Salmonella in macrophages. Recently, our research group demonstrated that Salmonella Typhimurium requires GtgE to survive intracellularly in a SCV-like compartment in the amoeba Dictyostelium discoideum. Bioinformatic analyses revealed that the genome of this amoeba encodes 4 Rab32 proteins (Rab32A–D), which have high amino acid similarity to mammalian Rab32 and contain the target sequence recognized by GtgE. Heterologous expression assays in Escherichia coli indicated that GtgE proteolyzes Rab32A, the only Rab32 from D. discoideum whose expression has been experimentally verified. In this study, recombinant plasmids were generated to express and purify the GTPase Rab32A from D. discoideum, the GtgE effector from S. Typhimurium, and a variant of this effector lacking its catalytic activity (GtgEH151A). All three proteins of interest were obtained as 6xHis-tagged fusion proteins in a commercial strain of E. coli. Inducible expression and soluble production of each protein were evaluated by SDS-PAGE and Western blot. Subsequently, the proteins were purified using affinity chromatography with a nickel-charged nitrilotriacetic acid (Ni-NTA) resin, and their identities were confirmed by SDS-PAGE and Western blot. Thus, highly enriched fractions of the effectors GtgE and GtgEH151A, as well as the molecular target Rab32A, were obtained. Finally, in vitro enzymatic assays were performed using the purified proteins to evaluate the proteolytic activity of GtgE on Rab32A, analyzing the reaction products by SDS-PAGE. These experiments confirmed the in vitro proteolytic activity of the S. Typhimurium effector GtgE on the monomeric GTPase Rab32A from D. discoideum.