Generación de una mutante de la proteína viral Tax de HTLV-1 y su expresión en células HeLa

Abstract

El virus linfotrópico de células T humana de tipo 1 (HTLV-1) fue el primer oncoretrovirus descubierto a principios de la década de 1980. Este virus es el agente etiológico de dos patologías principales: la leucemia/linfoma de células T del adulto (ATLL), un trastorno linfoproliferativo grave y mortal de las células T CD4+, y la mielopatía asociada a HTLV-1 o paraparesia espástica tropical (HAM/TSP), una enfermedad inflamatoria. Ambas enfermedades presentan manifestaciones clínicas graves y un pronóstico desfavorable, sin existir hasta la fecha una terapia antirretroviral (TAR) eficaz en uso clínico. El HTLV-1 es un virus complejo debido a la presencia de proteínas regulatorias, siendo la proteína Tax la más significativa. Tax interactúa con diversos factores celulares, alterando vías de señalización y procesos para favorecer la transcripción viral, persistencia y patogénesis. La localización subcelular de Tax está finamente regulada, resultado de una combinación elaborada de múltiples determinantes como el entorno. El estrés celular, provocado por agentes oxidantes o la propia infección viral, induce la formación de gránulos de estrés (SG) en la célula como respuesta para restaurar la homeostasis. Sin embargo, Tax, mediante su región N-terminal interacciona con dos componentes de los SG, USP10 y específicamente sus 22 primeros aminoácidos con HDAC6, desensamblando estos gránulos para favorecer la traducción de proteínas virales y aumentar los niveles intracelulares de especies reactivas de oxígeno (ROS), lo que promueve la leucogénesis. El propósito de esta Memoria de Título se centra en la generación de dos plásmidos: uno que codifica para la proteína Tax silvestre (WT) fusionada con GFP y otro que codifica la versión mutante, resultado de la deleción de los primeros 22 aminoácidos de Tax, también fusionada con GFP. Estas construcciones se expresaron en células HeLa para evaluar sus niveles de expresión proteica y su localización subcelular bajo tratamiento con arsenito de sodio (Ars). Mediante la técnica de Western Blot, se observó que los niveles de expresión de la versión mutante GFP-TaxΔ22 fueron menores en comparación con GFP-Tax WT. Sin embargo, al analizar la localización subcelular y la respuesta ante un agente estresor mediante inmunofluorescencia indirecta (IFI), se observaron diferencias entre ambas proteínas. GFP-Tax WT mostró una localización preferentemente nuclear y la formación de estructuras denominadas Tax Speckled Structures (TSS). Bajo tratamiento con Ars, esta proteína se translocó al citoplasma, formando focos discretos que no necesariamente co-localizan con los SG. Por otro lado, GFP-TaxΔ22 se distribuyó preferentemente a nivel citoplasmático y, ante el tratamiento con Ars, co-localizó con los SG, como se ha descrito previamente. Adicionalmente, se evidenció que la versión mutante de Tax se acumula a nivel extracelular o en células vecinas no transfectadas, lo que abre la posibilidad de futuros estudios sobre los mecanismos implicados en la secreción de esta proteína viral, dada su posible implicación en la progresión de HAM/TSP.

The Human T-lymphotropic Virus Type 1 (HTLV-1) was the first oncoretrovirus discovered in the early 1980s. This virus is the etiological agent of two major pathologies: Adult T-cell Leukemia/Lymphoma (ATLL), a severe and fatal CD4+ T-cell lymphoproliferative disorder, and HTLV-1-associated myelopathy or tropical spastic paraparesis (HAM/TSP), an inflammatory disease. Both diseases exhibit severe clinical manifestations and an unfavorable prognosis, with no effective antiretroviral therapy (ART) currently available for clinical use. HTLV-1 is a complex virus due to the presence of regulatory proteins, with Tax being the most significant. Tax interacts with various cellular factors, altering signaling pathways and processes to promote viral transcription, persistence, and pathogenesis. The subcellular localization of Tax is finely regulated, resulting from an intricate combination of multiple determinants, such as environmental conditions. Cellular stress, induced by oxidative agents or viral infection itself, triggers the formation of stress granules (SG) in the cell as a response to restore homeostasis. However, Tax, through its N-terminal region, interacts with two SG components, USP10, and specifically its first 22 amino acids with HDAC6, disassembling these granules to favor viral protein translation and increase intracellular reactive oxygen species (ROS) levels, thereby promoting leukemogenesis. The purpose of this work is focused on the generation of two plasmids: one encoding the wild-type (WT) Tax protein fused to GFP and another encoding the mutant version, resulting from the deletion of the first 22 amino acids of Tax, also fused to GFP. These constructs were expressed in HeLa cells to evaluate their protein expression levels and subcellular localization under sodium arsenite (Ars) treatment. Using Western Blot analysis, it was observed that the expression levels of the mutant GFP-TaxΔ22 version were lower compared to GFP-Tax WT. However, when analyzing subcellular localization and the response to a stressor via indirect immunofluorescence (IFI), differences between the two proteins were noted. GFP-Tax WT showed predominantly nuclear localization and the formation of structures termed Tax Speckled Structures (TSS). Under Ars treatment, this protein translocated to the cytoplasm, forming discrete foci that do not necessarily co-localize with SG. On the other hand, GFP-TaxΔ22 was distributed predominantly cytoplasmically, and upon Ars treatment, co-localized with SG, as previously described. Additionally, it was demonstrated that the mutant version of Tax accumulates extracellularly or in neighboring non-transfected cells, opening up the possibility for future studies on the mechanisms involved in the secretion of this viral protein, given its potential implication in the progression of HAM/TSP.