Caracterización estructural y cinética del sitio alostérico para AMP de la enzima bifuncional fosfofructoquinasa/glucoquinasa de Methanothermococcus thermolithotrophicus

Abstract

Los organismos del dominio Archaea presentan la ruta metabólica asociada a la degradación de glucosa, la glicólisis, pero con algunas modificaciones con respecto a lo descrito en Bacteria y Eucarya. Entre las principales diferencias, se encuentra la presencia de enzimas bifuncionales fosfofructoquinasa/glucoquinasa en el orden de los organismos Methanococcales, las que utilizan ADP como sustrato dador del fosforilo en vez de ATP. Estas enzimas, además, no presentan regulación alostérica por los efectores canónicos de la glicólisis, aunque recientemente se describió la activación por AMP de la enzima PFK/GK del organismo Methanococcus maripaludis (MmPFK/GK), donde se propone que el AMP es capaz de unirse en un sitio alostérico, el cual hasta la fecha no había sido identificado. En este trabajo se describe la identificación del sitio alostérico de unión a AMP, mediante cristalografía de rayos X, en una enzima homóloga a MmPFK/GK, perteneciente a la arquea metanogénica Methanothermococcus thermolitotrophicus (MttPFK/GK). También, se caracterizó el efecto activador de AMP en MttPFK/GK y de diferentes nucleótidos monofosfato y adenosina. Finalmente, a través de herramientas bioinformáticas, se analizó el sitio alostérico y los determinantes estructurales que definen la especificidad por el efector alostérico. A través del procesamiento de los datos obtenidos mediante difracción de rayos X se logró determinar estructuras de MttPFK/GK a una resolución de 1,25 – 1,30 Å, en conformación super-cerrada y con una molécula de AMP unida en el sitio alostérico. Interesantemente, el sitio alostérico se encuentra en la interfaz entre los dos dominios de la proteína. A diferencia de lo reportado en MmPFK/GK, la enzima MttPFK/GK presenta activación por diferentes nucleótidos con bases púricas y pirimidínicas, además de AMP y dAMP, en la actividad GK, mientras que en la actividad PFK el efecto es mucho menos promiscuo. Utilizando docking rígido, alineamiento estructural y AlphaFold, se propone que esta diferencia en la activación entre ambas enzimas homólogas y del mismo orden de arqueas es generada por la sustitución de aminoácidos polares ubicados en la zona donde se une el anillo de la base nitrogenada del AMP. Este es el primer trabajo donde se reporta la descripción del sitio alostérico para AMP en enzimas bifuncionales dependientes de ADP del orden Methanococcales, en donde se proponen los determinantes estructurales que dictan la especificidad de este sitio, además de los aminoácidos que podrían jugar un rol determinante en la unión del AMP. Los resultados obtenidos no solo contribuyen a una mejor comprensión de la regulación alostérica de la glicólisis de Archaea, sino que también pueden servir como base para futuros estudios que busquen manipular estas rutas metabólicas para aplicaciones biotecnológicas.