Identificación de productos de transformación generados durante la oxidación de clortetraciclina y sus isómeros por la enzima lacasa de Botrytis aclada mediante HPLC-MS

Abstract

Las lacasas son enzimas pertenecientes a la familia de las oxidasas multicobre, capaces de oxidar una gran variedad de compuestos orgánicos, usando oxígeno como aceptor final de electrones y generando agua como producto final de la reacción. Estas enzimas presentan tres dominios y cuatro átomos de cobre en su sitio activo. Las lacasas están presentes en diferentes grupos filogenéticos como bacterias, hongos, plantas e insectos, teniendo diferentes funciones dependiendo del organismo en donde se expresa, siendo la mayoría de ellas exportadas hacia el medio extracelular. Debido a que producen agua como producto final, estas enzimas son consideradas amigables con el medio ambiente, siendo utilizadas en diversas aplicaciones industriales, como en la biorremediación de antibióticos. Por su parte, las tetraciclinas son una familia de antibióticos de amplio espectro comúnmente utilizados en animales destinados al consumo humano y son los más estudiados con respecto a su biorremediación, debido a que son escasamente metabolizadas, liberándose hacia el medioambiente y promoviendo el incremento de la resistencia bacteriana. Además, se ha reportado que son persistentes, debido a que sufren mínimas modificaciones químicas estando en el medioambiente. Las tetraciclinas generan productos de transformación a medida que son oxidadas por algún agente físico, químico o biológico. Además, se encuentran en equilibrio con sus isómeros en solución, siendo estos afectados por el pH del medio. El objetivo de este estudio fue evaluar el efecto de la enzima lacasa del hongo ascomiceto Botrytis aclada en la oxidación de clortetraciclina y sus isómeros, en ausencia de mediador en un rango de pH entre 3 y 6, además de caracterizar los productos de transformación mediante HPLC-MS. Los resultados mostraron que la enzima lacasa fue capaz de oxidar a la clortetraciclina y a sus tres isómeros detectados, mientras que un cuarto isómero fue el único que se formó durante la reacción de oxidación. El análisis por HPLC-MS mostró la formación de productos de transformación ya descritos en la literatura, además de nuevos productos no descritos anteriormente. Esto permitió describir secuencias de reacciones enzimáticas y no enzimáticas que fueron caracterizadas en forma de vías. Los datos espectrométricos también indicaron la formación de homo y heterodímeros a partir de algunos productos de transformación formados por condensación. Este es el primer estudio en que se usó la lacasa del hongo ascomiceto B. aclada para oxidar clortetraciclina y sus isómeros en diferentes pHs.

Laccase are enzymes belonging to the multi-copper oxidase family, capable of oxidizing a wide variety of organic compounds, using oxygen as the final electron acceptor and generating water as the final product of the reaction. These enzymes have three domains and four copper atoms in their active site. Laccases are present in different phylogenetic groups such as bacteria, fungi, plants and insects, having different functions depending on the organism where they are expressed, most of them being exported to the extracellular medium. Due to the fact that they produce water as a final product, these enzymes are considered environmentally friendly, being used in several industrial applications, such as in the bioremediation of antibiotics. Tetracyclines are a family of broad-spectrum antibiotics commonly used in animals intended for human consumption and are the most studied with respect to their bioremediation, due to the fact that they are scarcely metabolized, being released into the environment and promoting the increase of bacterial resistance. In addition, they have been reported to be persistent, because they rarely undergo chemical modifications in the environment. Tetracyclines generate transformation products as they are oxidized by physical, chemical or biological agents. In addition, they are in equilibrium with their isomers in solution, which are affected by the pH of the medium. The aim of this study was to evaluate the effect of the laccase enzyme from the ascomycete fungus Botrytis aclada on the oxidation of chlortetracycline and its isomers in the absence of mediator in a pH range between 3 and 6 and to characterize the transformation products by HPLC-MS. The results showed that the laccase enzyme was able to oxidize chlortetracycline and its three detected isomers, while a fourth isomer was the only one formed during the oxidation reaction. HPLC-MS analysis showed the formation of transformation products already described in the literature, in addition to new products never described before. This allowed us to describe sequences of enzymatic and non-enzymatic reactions that were characterized in the form of pathways. Spectrometric data also indicated the formation of homo- and heterodimers from some transformation products formed by condensation. This is the first study in which laccase from the ascomycete fungus B. aclada was used to oxidize chlortetracycline and its isomers at different pHs.