El tratamiento con CRISPR-Cas9 y ARN guías específicos para los genes NDUFS2, MNT, MSR1 y FITM1 mediante CRISPR-Cas9 permiten la reactivación del provirus de VIH-1 en modelos celulares de microglías y linfocitos T

Abstract

El virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) es el agente etiológico del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), considerado una pandemia mundial, millones de personas viven con el virus y ha cobrado alrededor de 40 millones de vidas según lo reportado por la OMS/UNAIDS. VIH-1 infecta células que poseen el receptor CD4 y un correceptor CCR5 o CXCR4 que interactúan con las glicoproteínas de la envoltura del virión. La interacción permite el ingreso de la cápside viral en la célula, que transita hacia al núcleo, mientras ocurre la retrotranscripción del genoma viral, y posteriormente el denudamiento de la cápside. Gracias a la acción de la proteína viral integrasa, el genoma viral se integra al genoma celular, denominándose provirus, donde luego los procesos de síntesis de proteínas virales y liberación de partículas virales son comandados por la maquinaria celular. Aunque la terapia con antirretrovirales (TAR) ha mejorado la esperanza de vida de los pacientes al inhibir la replicación viral y la progresión de la infección, aún no existe una cura definitiva. Uno de los principales obstáculos en la lucha contra el VIH-1 es la presencia de la infección latente. Las células infectadas de forma latente albergan el ADN proviral de VIH-1 integrado en su genoma de manera inactiva y evitando así su detección por el sistema inmunológico del hospedero. Estas células actúan como reservorios virales, manteniendo la infección a lo largo de la vida del individuo. Diferentes subconjuntos de células T CD4+ en reposo, macrófagos y células del sistema nervioso central como células dendríticas y microglías constituyen el reservorio latente. Los estudios sobre la infección latente por VIH-1 aún no logran comprender por completo los mecanismos de establecimiento y mantenimiento involucrados en los diversos tipos celulares que componen este reservorio. Estudios de apagamiento (knockout o KO, por sus siglas en inglés) a gran escala se han utilizado ampliamente para identificar factores del hospedero implicados en la latencia de VIH-1. En los últimos años, la técnica que se ha popularizado para realizar screening con KO es CRISPR de genoma completo. En esta técnica se utiliza un ARN guía (sgRNA) para dirigir una nucleasa (Cas9) a un gen específico y provocar una ruptura de la doble cadena, la maquinaria celular repara la ruptura provocando mutaciones de inserción o deleción que terminan con un gen no funcional. En nuestro laboratorio, se realizó un screening KO basado en CRISPR-Cas9 en células Hμglia/HIV HC69, un modelo celular de latencia de microglías humanas que permite observar la reactivación del provirus de VIH-1 mediante la expresión de GFP. Se identificaron cientos de genes potenciales promotores de la latencia, de los cuales se seleccionaron 5 para realizar su validación individual. En la presente investigación, se propone que el apagamiento individual de los genes NDUFS2, SLC16A7, MNT, MSR1 y FITM1 mediante CRISPR-Cas9 permiten la reactivación del provirus de VIH-1 en modelos celulares de Microglías y Linfocitos T. Para responder a esta hipótesis, se realizó como primer objetivo la validación individual de 5 genes del hospedero identificados como promotores de la latencia de VIH-1 en el modelo microglial (Hμglia/HIV HC69). Para esto, se generaron KO individuales usando la metodología CRISPR-Cas9, y se identificó la reactivación del provirus latente mediante la evaluación de la expresión de GFP por citometría de flujo y la expresión de la proteína Cas9-Flag y GFP a través de Western blot. Estos experimentos confirmaron 4 genes como promotores de la latencia en este modelo, NDUFS2, MNT, MSR1 y FITM1. En el segundo objetivo se realizó la evaluación de la contribución de los genes validados en el objetivo 1 en un modelo de latencia de células T clonales (J-Lat 10.6). Este modelo permite también observar la reactivación del provirus de VIH-1 mediante expresión de GFP, por lo que se realizó el mismo procedimiento para la generación de KO individuales en J-Lat 10.6 y se evaluó la reactivación de la latencia mediante la expresión de GFP usando citometría de flujo y la expresión de Cas9-Flag, GFP y de p24 de VIH-1 a través de Western blot. Nuestros resultados indican que el tratamiento con CRISPR-Cas9 y ARN guías específicos para los genes NDUFS2, MNT, MSR1 y FITM1 permite la reactivación del provirus de VIH-1 en modelos celulares de Microglías y Linfocitos T. Nuestros hallazgos ofrecen una nueva perspectiva sobre los posibles mecanismos involucrados en la infección latente en microglías y linfocitos T. Teniendo el potencial de respaldar el desarrollo de estrategias terapéuticas innovadoras para combatir el VIH.

The Human Immunodeficiency Virus type 1 (HIV-1) is the etiological agent of Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS), which is considered a global pandemic. Millions of individuals live with the virus, and it has claimed approximately 40 million lives according to reports from OMS/UNAIDS. HIV-1 infects cells that express the CD4 receptor and either the CCR5 or CXCR4 co-receptor, which interact with the virion envelope glycoproteins. This interaction facilitates the entry of the viral capsid into the cell, which then translocates to the nucleus while the retrotranscription of the viral genome occurs, followed by the uncoating of the capsid. Through the action of the viral integrase protein, the viral genome integrates into the cellular genome, forming a provirus, where subsequent processes of viral protein synthesis and viral particle release are directed by the cellular machinery. Although antiretroviral therapy (ART) has improved the life expectancy of patients by inhibiting viral replication and disease progression, a definitive cure remains elusive. One of the primary obstacles in the fight against HIV-1 is the presence of latent infection. Latently infected cells harbor the proviral DNA of HIV-1 integrated into their genome in an inactive state, thereby evading detection by the host's immune system. These cells act as viral reservoirs, maintaining the infection throughout the individual's life. Various subsets of resting CD4+ T cells, macrophages, and central nervous system cells such as dendritic cells and microglia constitute the latent reservoir. Studies on HIV-1 latent infection have yet to fully elucidate the mechanisms of establishment and maintenance involved in the diverse cell types that comprise this reservoir. Large-scale knockout (KO) studies have been widely utilized to identify host factors implicated in HIV-1 latency. In recent years, the technique that has gained popularity for conducting KO screenings is whole-genome CRISPR. This technique employs a guide RNA (sgRNA) to direct a nuclease (Cas9) to a specific gene, inducing a double-strand break, which the cellular machinery repairs, resulting in insertion or deletion mutations that render the gene non-functional. In our laboratory, a CRISPR-Cas9-based KO screening was conducted in Hμglia/HIV HC69 cells, a cellular model of human microglial latency that allows for the observation of HIV-1 provirus reactivation through GFP expression. Hundreds of potential latency-promoting genes were identified, of which five were selected for individual validation. This research proposes that the individual knockout of the genes NDUFS2, SLC16A7, MNT, MSR1, and FITM1 via CRISPR-Cas9 facilitates the reactivation of HIV-1 provirus in microglial and T lymphocyte cellular models. To address this hypothesis, the first objective was the individual validation of the five host genes identified as promoters of HIV-1 latency in the microglial model (Hμglia/HIV HC69). Individual KOs were generated using the CRISPR-Cas9 methodology, and the reactivation of latent provirus was assessed by evaluating GFP expression via flow cytometry and the expression of Cas9-Flag and GFP through Western blot. These experiments confirmed four genes as latency promoters in this model: NDUFS2, MNT, MSR1, and FITM1. The second objective involved evaluating the contribution of the validated genes from objective 1 in a model of clonal T cell latency (J-Lat 10.6). This model also allows for the observation of HIV-1 provirus reactivation via GFP expression; thus, the same procedure was performed for generating individual KOs in J-Lat 10.6, and latency reactivation was assessed through GFP expression using flow cytometry and the expression of Cas9-Flag, GFP, and HIV-1 p24 via Western blot. Our results indicate that treatment with CRISPR-Cas9 and specific guide RNAs for the genes NDUFS2, MNT, MSR1, and FITM1 allows for the reactivation of HIV-1 provirus in microglial and T lymphocyte cellular models. Our findings provide a new perspective on the potential mechanisms involved in latent infection in microglia and T lymphocytes, holding the potential to support the development of innovative therapeutic strategies to combat HIV.