Identificación de metabolitos de tipo sideróforos del hongo antártico Pseudogymnoascus verrucosus

Abstract

Los sideróforos son compuestos orgánicos quelantes de hierro, de bajo peso molecular, y producidos por la mayoría de los microorganismos, especialmente bacterias y hongos. Dado que el ion férrico no es soluble en el rango de pH fisiológico (pH 7,30-7,40), los microorganismos han evolucionado a la biosíntesis de estos compuestos los cuales poseen una fuerte afinidad por los iones Fe+3, formando complejos que favorecen la solubilidad del metal en el citoplasma y que también facilitan su transporte a través de la pared celular y la membrana plasmática. Los sideróforos de origen fúngico corresponden mayoritariamente a sideróforos del tipo hidroxamato, los cuales se clasifican a su vez en ferricromos, coprógenos y fusarininas. El tipo o tipos de sideróforos producidos por los hongos es específico según el género fúngico al que pertenecen, existiendo aún muchos géneros donde el estudio de sideróforos aún no ha sido abordado. Ese es el caso del género Pseudogymnoascus, un hongo prevalente en ambientes fríos como la Antártica. Este proyecto tiene como finalidad el estudio de los compuestos sideróforos del hongo antártico Pseudogymnoascus verrucosus FAE27. Con el fin de detectar, e identificar los sideróforos producidos por esta cepa se llevaron a cabo experimentos preliminares utilizando técnicas de TLC y LC-MS que evidenciaron la presencia de compuestos que son capaces de acomplejarse con Fe3+ en los caldos de cultivo de P. verrucosus FAE27. Adicionalmente, los análisis de LC-MS mostraron que algunos de estos compuestos eran sideróforos conocidos, de la familia de las fusarininas, pero también que existían compuestos sideróforos cuya estructura aún no estaba reportada. Así, con el fin de caracterizar espectroscópicamente estos compuestos, se procedió a quelarlos con Ga+3 y a purificarlos mediante un protocolo desarrollado en esta Tesis. Como resultado, se obtuvieron nueve compuestos, cuya identificación utilizando RMN y HRMS-ESI, mostró que todos los sideróforos identificados en el hongo antártico P. verrucosus FAE27 corresponden a sideróforos del tipo hidroxamato de la familia de las fusarininas. En concreto, dos de los compuestos aislados corresponden a sideróforos nuevos no reportados anteriormente; N,N’-diacetil-Z-L-fusarinina B y N-acetil-L-Z-fusarinina A, tres compuestos han sido descritos anteriormente en otros organismos; N,N’,N’’-triacetil-Z-L-fusarinina C, N,N’,N’’-triacetil-Z-L-fusarinina B y N,N’-diacetil-Z-L-fusarinina A. También fueron identificados tres compuestos que corresponden a monómeros que no se encuentran acomplejados con metal, N-acetil-Z-L-fusarinina, N-acetil-Z-L-fusarinina-metiléster y Z-L-fusarinina. Por último, se identificó un derivado de la hidrólisis de las fusarininas, 4-metil-5,6-dihidro-2H-piran-2-ona. Si bien la mayoría de estos compuestos se habían reportado en la literatura, su identificación se basó en datos de HRMS-ESI, no habiéndose publicado previamente la identificación estructural completa mediante RMN. En este aspecto en concreto, este trabajo de Tesis realiza una importante contribución. Finalmente, mediante bioensayos de captación de hierro, se comprobó la actividad como sideróforos de todos los compuestos identificados, con excepción del derivado procedente de la hidrólisis.

Siderophores are low molecular weight iron-chelating organic compounds produced by most microorganisms, particularly bacteria and fungi. Since ferric ions are not soluble within the physiological pH range (pH 7.30-7.40), microorganisms have evolved to biosynthesize these compounds, which have a strong affinity for Fe3+ ions. This allows the formation of complexes that enhance the solubility of the metal in the cytoplasm and facilitate its transport through the cell wall and plasma membrane. Fungal siderophores are predominantly of the hydroxamate type, which are further classified into ferrichromes, coprogens, and fusarinines. The type(s) of siderophores produced by fungi are specific to the fungal genera to which they belong, and there are still many genera where siderophore studies have not yet been addressed. This is the case for the genus Pseudogymnoascus, a fungus prevalent in cold environments like Antarctica. This project aims to study the siderophore compounds of the Antarctic fungus Pseudogymnoascus verrucosus FAE27. To detect and identify the siderophores produced by this strain, preliminary experiments were carried out using TLC and LC-MS techniques, which revealed the presence of compounds capable of complexing with Fe3+ in the culture broths of P. verrucosus FAE27. Additionally, LC-MS analyses showed that some of these compounds were known siderophores from the fusarinine family, but there were also siderophore compounds whose structures had not yet been reported. Therefore, to spectroscopically characterize these compounds, they were chelated with Ga3+ and purified using a protocol developed in this Thesis. As a result, nine compounds were obtained, and their identification using NMR and HRMS-ESI showed that all the siderophores identified in the Antarctic fungus P. verrucosus FAE27 belong to the hydroxamate-type fusarinine family. Specifically, two of the isolated compounds were novel siderophores previously unreported: N,N’-diacetyl-Z-L-fusarinine B and N-acetyl-L-Z-fusarinine A. Three compounds had been previously described in other organisms: N,N’,N’’-triacetyl-Z-L-fusarinine C, N,N’,N’’-triacetyl-Z-L-fusarinine B, and N,N’-diacetyl-Z-L-fusarinine A. Additionally, three compounds were identified as monomers not complexed with metal: N-acetyl-Z-L-fusarinine, N-acetyl-Z-L-fusarinine methylester, and Z-L-fusarinine. Finally, a hydrolysis derivative of fusarinines, 4-methyl-5,6-dihydro-2H-pyran-2-one, was identified. While most of these compounds had been reported in the literature, their identification was based on HRMS-ESI data, and their complete structural identification via NMR had not been published before. In this specific aspect, this Thesis makes a significant contribution. Finally, through iron uptake bioassays, the siderophore activity of all identified compounds, except for the hydrolysis derivative, was confirmed.