Regulación de la homeostasis tisular en endometrios de mujeres con síndrome de ovario poliquistico

Abstract

Los esteroides ováricos, principalmente 17β-estradiol (E2) y progesterona (P4), ejercen acciones regulatorias sobre el endometrio asociadas a cambios morfológicos, con una ciclicidad mensual. Esto permite clasificar al endometrio en endometrio de fase proliferativa o secretora, cada una de estas fases con características propias. En los últimos años se le ha dado especial importancia al hecho de que las concentraciones tisulares de los esteroides en los tejidos sensibles a ellos, no se relacionan directamente con las concentraciones hormonales en la sangre. Se ha planteado que los tejidos sensibles a esteroides podrían regular in-situ las concentraciones de éstos. De este modo, en patologías como el síndrome de ovario poliquístico (SOP), que se caracteriza por alteraciones endocrino-metabólicas importantes, podemos esperar que los endometrios de estas pacientes posean un metabolismo esteroidal diferente al de los endometrios controles. El SOP es un desorden frecuente que afecta del 5 al 10 % de las mujeres en edad reproductiva. Se ha establecido que se debe considerar paciente SOP a una mujer si cumple con al menos dos de los siguientes criterios: i) Oligo o anovulación; ii) Signos clínicos o bioquímicos de hiperandrogenismo; iii) Ovarios poliquísticos a la ultrasonografía. Además, se deben excluir otras patologías como hiperplasia adrenal congénita, tumores secretores de andrógenos y síndrome de Cushing´s. Existen evidencias de que el SOP constituye un factor de riesgo para hiperplasia endometrial (HE) y carcinoma endometrial (CE). El riesgo de HE para pacientes SOP se relacionaría de manera importante a la acción mitogénica de E2 no compensada por P4 en los ciclos anovulatorios. Además, la asociación entre SOP y CE ha sido sugerida por más de 50 años. En efecto, el Colegio Americano de Obstetricia y Ginecología (2002) destacó que la anovulación crónica, la obesidad, la hiperinsulinemia y una disminución en la concentración de SHBG (globulina ligante de hormonas sexuales plasmática), características que se observan en pacientes SOP, constituyen factores de riesgo para CE. En consecuencia, los objetivos de esta tesis fueron establecer si en endometrios SOP se modifica el metabolismo de hormonas esteroidales y la expresión y actividad de proteínas reguladoras de la homeostasis tisular. Así mismo, evaluar in-vitro si las condiciones hiperestrogénica (E2), hiperandrogénica (testosterona-T- o androstenediona-A4-) y/o hiperinsulínica, contribuyen a modificar el metabolismo esteroidal, así como, la expresión y activación de moléculas que participan significativamente en vías de señalización relacionadas con proliferación y apoptosis. Materiales y Métodos: Para llevar a cabo el estudio se utilizaron 23 endometrios de mujeres con fertilidad probada en fase proliferativa del ciclo menstrual (ENp), 28 endometrios de pacientes SOP sin y con hiperplasia endometrial (ESOP, n=18; y ESOPH, n=10, respectivamente), y de mujeres con hiperplasia endometrial (HE, n=10). En el estudio ex-vivo, fueron evaluadas las actividades de las enzimas del metabolismo esteroidal Sulfatasa, Sulfotransferasa (EST) y 17 β -hidroxiesteroide deshidrogenasa 1(7 β -HSD) tipo 2; los niveles de mRNA y/o proteína por técnicas de RT-PCR, inmunohistoquímica (IHQ) y/o western blot (WB) de las enzimas del metabolismo esteroidal ya mencionadas, además de las de P450-aromatasa y 5α-reductasa. Adicionalmente, se determinó el nivel génico y proteico de la proteína SHBG que podría regular la actividad de los esteroides in-situ; y las concentraciones de esteroides intracelulares por radioinmunoensayo (RIA) (E2, P4, A4, T); la forma fosforilada del receptor de estrógenos en Ser 118 (pREα-Ser118); los co-reguladores de receptores esteroidales ARA70 y NCoR y β-catenina; las proteínas Smad2, Smad3, Smad4 y sus formas fosforiladas; ciclina D1, E y el inhibidor de ciclina p27. Se determinó, además, el grado de proliferación por IHQ para Ki67 e histona H3 fosforilada en Ser 10 (pH3) y apoptosis por TUNEL e IHQ de Caspasa-3. En los estudios in-vitro se investigó la acción de insulina, E2 y A4 adicionados al medio de cultivo de endometrios controles sobre los niveles de las formas fosforiladas de las proteínas Smad2 y 3 (pSmad2 y pSmad3). Además, se determinó el efecto de la T adicionada al medio de cultivo de explantes endometriales normales de fase proliferativa y secretora, sobre la producción de E2 y de dihidrotestosterona (DHT). Se realizó el mismo estudio para células estromales y epiteliales cultivadas aisladamente. Los resultados obtenidos in-vitro para la P450-aromatasa muestran que existe un aumento de E2 al adicionar andrógenos al sistema de cultivo de células endometriales. No obstante, no se encontró mRNA ni proteína para P450-aromatasa en los grupos de endometrios analizados ex-vivo. Lo anteriormente expuesto nos permite plantear que la aromatización de andrógenos a estrógenos no sería un mecanismo importante para la producción in-situ de estrógenos en los endometrios controles y de pacientes SOP analizados en este estudio. Se observó la presencia de mRNA y de la actividad de sulfatasa y en menor grado, la de EST en los endometrios humanos de todos los grupos analizados. Los niveles de mRNA para las enzimas sulfatasa y EST en ESOP, respecto a ENp, fueron resultados concordantes con la menor relación entre las actividades Sulfatasa y EST obtenida en los endometrios ESOP y ESOPH respecto al control. Lo anteriormente expuesto podría relacionarse con una menor tendencia a la formación de las formas libres de estos esteroides respecto a las formas sulfatadas; esto contrasta con la menor actividad 17β-HSD tipo 2 encontrada en los ESOP. Lo anterior indicaría que los ESOP tendrían una menor tendencia a la formación de estrona (E1) utilizando E2 como sustrato. Por otra parte, la enzima 5α-reductasa tipo 1 fue detectada en ENp, lo que en conjunto con los resultados obtenidos in-vitro, sugieren que el endometrio humano posee una alta capacidad de transformación de T en DHT. Adicionalmente, el aumento progresivo encontrado en los niveles de esta enzima en epitelio glandular desde ENp hasta ESOPH, nos inducen fuertemente a plantear que la formación de DHT a partir de T en el epitelio endometrial podría desempeñar un papel importante en el desarrollo de hiperplasia endometrial que se da en algunas pacientes con SOP. Por otro lado, la disminución en los niveles de la enzima 5α-reductasa en el estroma de ESOP, ESOPH y HE respecto a ENp, sugiere que la DHT podría tener acciones diferentes en las células estromales respecto a las epiteliales. Es importante destacar que el presente trabajo constituye el primero en describir alteraciones en las enzimas del metabolismo esteroidal en endometrios de mujeres con SOP. Otro factor importante en la biodisponibilidad de esteroides es la SHBG. En este trabajo encontramos que los productos génicos mRNA 341pb (mRNAT) y principalmente mRNA 548pb (mRNAL), se transcriben en endometrio humano. La menor razón entre los mRNA 548pb/341pb encontrada para los endometrios de pacientes con HE, pudiese significar que la regulación del empalme (splicing) de mRNA para SHBG constituye una transformación importante en el desarrollo de HE no SOP. Por otra parte, encontramos por primera vez la presencia de la proteína SHBG en endometrio humano. Esta proteína resultó estar presente en todos los endometrios estudiados, por lo tanto, SHBG podría jugar un papel importante en la regulación de la biodisponibilidad esteroidal in-situ en estos endometrios, lo cual sería diferente en los ESOP dada la disminución en su expresión. La alta expresión citoplasmática del co-activador de receptores esteroidales ARA70 en todos los grupos estudiados, unido a los niveles menores del co-represor NCoR en los núcleos de los ESOP, indicaría en conjunto con los resultados expuestos anteriormente, mayor sensibilidad a la acción esteroidal en estos endometrios. otro lado, se sabe que las modificaciones post-traduccionales de los receptores esteroidales modifican su actividad. Los resultados de esta investigación muestran que la fracción de REα fosforilada en Ser 118 respecto a REα total (pREαSer118), fue mayor en ESOP, ESOPH y HE respecto a ENp. Lo anterior nos permite sugerir que el aumento en pREαSer118 en los endometrios patológicos estudiados, pudiese asociarse a una regulación positiva de la actividad transcripcional del receptor, adicional a los factores anteriormente planteados. Como consecuencia, podría desregular la transcripción de genes involucrados en el control del ciclo celular, y estas alteraciones podrían conducir al desarrollo de hiperplasia endometrial en mujeres SOP. Por lo tanto, es altamente probable que exista una desregulación del ciclo celular de las células endometriales en estas pacientes. Se sabe que, la ciclina D1, ciclina E y p27 son importantes reguladores del ciclo celular. Los resultados de la evaluación de ciclina D1 mostraron una localización subcelular de preferencia citoplasmática en todos los endometrios analizados; además, los ESOP exhibieron niveles más altos de la proteína, tanto en el compartimiento nuclear como en los citoplasmas celulares, respecto de los endometrios controles. Los mayores niveles de ciclina D1 observados en los núcleos celulares de ESOP respecto a ENp contribuirían a la mayor proliferación celular de estos endometrios. Los niveles superiores observados para esta proteína en los citoplasmas celulares de los ESOP podrían, también, ser importantes en la progresión de la enfermedad hacia hiperplasia y cáncer endometrial. Otro de los reguladores positivos del ciclo celular analizados en este estudio fue la ciclina E. Esta fue detectada principalmente en las células epiteliales de los grupos de endometrios en estudio, y su expresión fue similar entre los grupos con excepción de los endometrios con HE, para los cuales la acción mayor de ciclina E podría jugar un papel fundamental en la génesis de esta patología. Por lo tanto, podemos sugerir que en los ESOP y ESOPH, aún no existe una desregulación en la expresión de esta proteína. No obstante, la importante reducción de la expresión nuclear de p27, regulador negativo del ciclo celular, en las células estromales de pacientes SOP con y sin hiperplasia, indicarían una menor restricción a la proliferación celular en estos endometrios. De esta manera, el estudio de la proteína Ki67 reveló un aumento del número de células en ciclo celular en endometrios de pacientes SOP, en ausencia de apoptosis. Esta última fue evidenciada a través de la no detección de caspasa-3-activa ni de la fragmentación del DNA por TUNEL. Además, medimos el marcador de proliferación celular pH3, cuya inmunotinción fue similar en ESOP respecto a los endometrios controles. Es importante recordar que los ENp presentan una alta capacidad proliferativa. De este modo, los datos de esta investigación sugieren que las pacientes SOP presentan una desregulación de su homeostasis endometrial, con un mayor número de células en ciclo celular de lo cual se infiere que tendrían la potencialidad de atravesar el punto de control del ciclo celular G2/M. Además, en los ESOP, es de destacar que dado: i) el microambiente hormonal anormal en que funcionan las células endometriales de estas pacientes, ii) la mayor proliferación que presentan estas células, iii) la vida media más prolongada de las células endometriales, por la ausencia de la acción descamatoria cíclica de P4.(pacientes con oligomenorrea y amenorrea), y iv) la ausencia de apoptosis, sugerimos una alta probabilidad de que las células de estos endometrios acumulen mutaciones que pueden resultar finalmente en hiperplasia y carcinoma endometrial. Con el propósito de conocer mejor los mecanismos reguladores de la homeostasis en el tejido endometrial, evaluamos la participación de la vía de las Smads en dichos procesos, tanto en tejidos normales como patológicos. Los resultados indican que estas proteínas y sus formas activas se encuentran disminuidas en los ESOP y ESOPH, lo cual sugiere que en los ESOP existe disminución de la actividad supresora del paso de la fase G1 a la fase S del ciclo celular a través de esta vía, induciendo la progresión del ciclo celular. Al analizar los niveles de la proteína Smad4 in-vitro se encontró que E2 y fundamentalmente A4 disminuyen la presencia de Smad4 en los núcleos celulares de las células cultivadas. Estos resultados indican que estas proteínas son reguladas por las concentraciones de esteroides. Otra de las proteínas investigadas en este contexto en los endometrios fue β-catenina. Los niveles superiores de la forma activa de esta proteína encontrados en los ESOP, ESOPH e HE respecto a ENp, constituyen un paso importante en el conocimiento de cuáles son los cambios primarios que pueden ocurrir en un tejido que podrían conducir finalmente a su malignización. Conclusiones: Concordantemente con nuestra proposición, los resultados obtenidos en esta tesis nos permiten plantear que los endometrios obtenidos de pacientes con SOP poseen una biodisponibilidad esteroidal propia que pudiese alterar la expresión y actividad de reguladores de la homeostasis tisular. Esto tendría como consecuencia un mayor potencial proliferativo de estos endometrios, con el riesgo mayor asociado de hiperplasia y carcinoma endometrial. Además, proponemos que los ESOP pueden constituir un modelo para el estudio y la mejor comprensión de cuáles son los primeros pasos en la desregulación de la homeostasis celular endometrial. Además, y según los resultados de este trabajo, proponemos que a pesar de la similitud morfológica de ESOPH y HE y del ambiente hormonal similar en que se desarrollan ESOP y ESOPH, estos tres tipos de endometrios son molecularmente diferentes, lo cuál podría ser importante en el manejo terapéutico de estas pacientes.