Producción de flavoproteínas monooxigenasas putativas provenientes de actinomicetos aislados del lupino del desierto de Atacama

Abstract

Las flavoproteínas monooxigenasas (FPMOs) de clase B son enzimas de amplio interés industrial ya que están involucradas en procesos biológicos que incluyen la degradación de lignina, biosíntesis de metabolitos secundarios complejos, y desintoxicación de compuestos xenobióticos.

Recientemente se han reportado FPMOs originarias de los microorganismos S. leeuwenhoekii C34 y de Thermocrispum municipale que cuentan con gran potencial biotecnológico dada su elevada termoestabilidad y tolerancia a disolventes. Dichas enzimas sirvieron como referencia en un estudio previo para seleccionar bioinformáticamente FPMOs putativas provenientes de actinomicetos del Lupino del Desierto de Atacama. De esta selección, se puso a prueba la expresión de cuatro enzimas utilizando el sistema E. coli TOP10 pBAD-His-Tag-SUMO (que produce las proteínas en el citoplasma) donde se observó que dos de estas FPMOs no se expresaron, mientras que las dos restantes se expresaron en la fase insoluble, pese a las modificaciones que se realizaron en las condiciones de cultivo. De esta manera, dado el potencial de las FPMOs putativas seleccionadas producto de su similitud con las extremozimas mencionadas nace el siguiente trabajo de título, el cual consiste en evaluar alternativas para expresar estas enzimas de manera soluble y activa.

Para este estudio se expresaron las FPMOs putativas MO1, MO4 (ambas con la etiqueta proteica ”SUMO”, que regula la localización, solubilidad y estabilidad de las proteínas), G35A_MO y G35A_MO_SUMO en el sistema E.coli NiCO21 (DE3) pET22b(+), que facilita el transporte de proteínas al periplasma. De los ensayos realizados se pudo concluir que existió expresión en la fase soluble para todas las enzimas luego de la inducción con IPTG 0,3 mM en ensayos a nivel de matraces de 1 L con 200 mL de medio LB fosfato de sodio 0,1 M y glicerol 3 g/L. Esta diferencia en la expresión con el estudio de referencia se atribuye al transporte de las enzimas al periplasma, lugar que propicia el correcto plegamiento de las proteínas mediante la formación de enlaces disulfuro, lo que está impedido en el citoplasma por la presencia de enzimas que favorecen la reducción de cisteínas.

Con el fin de caracterizar las enzimas producidas se evaluó la desaparición de NADPH en presencia de los sustratos biciclo[3.2.0]hept-2-en-6-ona, tioanisol, ciclohexanona y fenilalanina, de donde se concluyó que los mayores niveles de catálisis fueron para G35A_MO_SUMO con biciclo[3.2.0]hept-2-en-6-ona. A partir de estos resultados se evaluó la expresión de G35A_MO_SUMO con inducción tanto en fase temprana como tardía de crecimiento, midiendo su actividad catalítica usando biciclo[3.2.0]hept-2-en-6-ona. De esto se concluyó que existe una mayor actividad específica cuando la inducción se realiza durante la fase tardía (3,4 veces la actividad obtenida en la inducción en fase temprana), lo que se atribuye a la presencia de una mayor cantidad de enzima en el extracto soluble debido a una síntesis proteica más controlada (dado un metabolismo menos activo) en esta etapa de crecimiento celular.