Evaluación de estrategias para biotransformaciones catalizadas por monooxigenasas utilizando células enteras de escherichia coli recombinante

Abstract

Las monooxigenasas de Baeyer-Villiger son enzimas que catalizan la reacción que permite transformar una cetona lineal en un éster o convertir una cetona cíclica en una lactona. La e-caprolactona, resultado de esta reacción catalizada por enzimas utilizando ciclohexanona como sustrato, es de relevancia en el ámbito industrial, ya que puede ser empleada en la síntesis de materiales con valor agregado, como biopolímeros, por lo que surge la motivación de mejorar las condiciones bajo las cuales se lleva a cabo la reacción enzimática antes mencionada. Es por esto que, el objetivo del trabajo de memoria corresponde a evaluar estrategias para el proceso de biotransformación de ciclohexanona a e-caprolactona a nivel de matraces, catalizado por la enzima ciclohexanona monooxigenasa derivada de la bacteria Thermocrispum municipale (TmCHMO) y empleando un sistema de células enteras de Escherichia coli TOP10 con el plásmido pBAD-His-Tag-SUMO-TmCHMO, para establecer las condiciones de operación que mejoran el rendimiento del sustrato de la reacción.

Este proceso constó de dos etapas, una etapa de crecimiento y otra de biotransformación. La primera etapa permitió estudiar la cinética de crecimiento y obtención de biomasa para la biotransformación, donde se probaron 3 concentraciones de glicerol en el medio de cultivo (5, 10 y 15 g/L). Para una concentración de 5 g/L se obtuvo una velocidad específica de crecimiento máxima de 1,546 ± 0,008 [1/h] y un rendimiento de glicerol en biomasa de 0,269 ± 0,033 [g/g]. Los resultados mostraron diferencias significativas comparados con las otras concentraciones estudiadas, permitiendo seleccionar la concentración de 5 g/L de glicerol a utilizar para el crecimiento celular. Posteriormente, la máxima actividad enzimática específica de la TmCHMO fue de 35,8 ± 7,2 [UI/mg_proteína] a las 4 horas luego de agregar L-arabinosa 0,1% p/v. A continuación, se realizaron ensayos de biotransformación en un medio de no crecimiento celular, utilizando glicerol para la regeneración del cofactor NADPH que participa en la reacción. Se estudiaron 3 concentraciones de ciclohexanona, variando entre 3 concentraciones de biomasa, obteniéndose un consumo de sustrato óptimo al emplear 15 mM de ciclohexanona y 15 g/L de biomasa, sin embargo, los resultados obtenidos no permitieron concluir la existencia de inhibición por sustrato. Este ensayo se comparó con una estrategia de biotransformación alternativa para un sistema conformado por citrato, NADP+ y MgCl2, aunque en este caso no se obtuvo un mayor consumo de ciclohexanona que en el sistema donde se emplea glicerol, siendo este último más eficiente en la generación de poder reductor. A partir de lo obtenido, se planteó una estrategia que incluye adicionar 15 mM de ciclohexanona en el medio de biotransformación con una concentración de 15 g/L de biomasa. De esta manera, se cumplieron los objetivos planteados en el trabajo, a pesar de que se debe continuar a futuro con el estudio de otros factores que puedan afectar el proceso de biotransformación.