Evaluación del efecto de las vesículas extracelulares pequeñas que transportan ECA2 activada farmacológicamente en la prevención del fenotipo desdiferenciado de células musculares lisas A7r5

Abstract

Introducción: Las enfermedades cardiovasculares son la principal causa de muerte a nivel mundial. Estas patologías provocan remodelado en el corazón y vasos sanguíneos. La desdiferenciación de células del músculo liso vascular (CMLV) contribuye al deterioro vascular, subrayando la necesidad de nuevas alternativas terapéuticas. Las vesículas extracelulares (VE) endoteliales inhiben la migración de CMLV y tienen efectos cardioprotectores. Por otra parte, la enzima convertidora de angiotensina 2 (ECA2) se transporta en VE y ejerce efectos cardiovasculares protectores. Sin embargo, no se ha determinado si las VE aisladas de células tratadas con un activador farmacológico de ECA2 son más efectivas para prevenir la desdiferenciación de las CMLV. Hipótesis: La activación farmacológica de la ECA2 en VE pequeñas provenientes de células endoteliales, aumentan su efecto preventivo de la desdiferenciación de CMLV A7r5 inducida por PDGF-BB. Métodos: Las CMLV se desdiferenciaron tratando las células A7r5 con factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB (PDGF-BB) 20 ng/mL por 24 h para ensayos de migración o 48 h para evaluar proteínas contráctiles. Los efectos del activador de la ECA2, diminaceno aceturato (DIZE), y VE de células tratadas con o sin DIZE se evaluaron mediante pretratamientos de 30 min previo a la administración de PDGF-BB. Los ensayos de citotoxicidad se determinaron evaluando láctico deshidrogenasa (LDH), y la desdiferenciación de las CMLV por migración por cierre de herida, y proteínas contráctiles mediante Western blot. Las VE se aislaron de células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC), mediante cromatografía de exclusión por tamaño y se caracterizaron mediante el uso de NanoSight, microscopía electrónica y Western blot para evaluar marcadores de superficie. Resultados: DIZE no indujo citotoxicidad en A7r5. PDGF-BB aumentó la migración por cierre de herida a las 24 h, pero este efecto se previno por el pretratamiento con DIZE a 3,3 μM (n=3), pero no con 1 μM de DIZE (n=5). Las VE de células endoteliales tratadas con DIZE a 1 μM también previnieron la migración inducida por PDGF-BB (n=6). Los análisis por Western blot mostraron que DIZE previno la reducción de los niveles de las proteínas contráctiles inducida por PDGF-BB (n=5), al igual que las VE aisladas de células tratadas con o sin DIZE 1 μM (n=4). Conclusión: Estos hallazgos sugieren que DIZE no aumentó la eficacia de las VE en la prevención de la desdiferenciación de CMLV, pero el fármaco sí tuvo un efecto directo en las CMLV, lo que sugiere un potencial efecto mediado por la activación ECA2, abriendo nuevas vías para su uso terapéutico en enfermedades cardiovasculares.

Introduction: Cardiovascular diseases are the leading cause of death worldwide. These pathologies cause remodeling in the heart and blood vessels. Dedifferentiation of vascular smooth muscle cells (VSMC) contributes to vascular deterioration, highlighting the need for new therapeutic alternatives. Endothelial extracellular vesicles (EVs) inhibit VSMC migration and have cardioprotective effects. On the other hand, angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) is transported in EVs and exerts cardiovascular protective effects. However, whether EVs isolated from cells treated with a pharmacological activator of ACE2 are more effective in preventing dedifferentiation was not determined. Hypothesis: Pharmacological activation of ACE2 in small EVs from endothelial cells increases its preventive effect of PDGF-BB-induced A7r5 VSMC dedifferentiation. Methods: Dedifferentiated VSMC was generated by treating A7r5 cells with PDGF-BB 20 ng/ml for 24 h for migration assays or 48 h to assess contractile proteins. The effects of the ACE2 activator, diminazene aceturate (DIZE), on EVs from cells treated with or without DIZE were assessed by 30-min pretreatment before PDGF-BB administration. Cytotoxicity was assessed by LDH, and VSMC dedifferentiation by wound closure migration assays, and contractile protein assessment by Western blotting. EVs were isolated from human umbilical endothelial cells (HUVEC) by size exclusion chromatography and characterized using NanoSight, electron microscopy, and Western blotting to assess surface markers. Results: DIZE did not induce cytotoxicity in A7r5. In migration assays, PDGF-BB increased wound closure at 24 h, but this effect was prevented by pretreatment with DIZE at 3.3 μM (n=3). However, this effect was not observed with 1 μM DIZE (n=5). EVs from endothelial cells treated with 1 μM DIZE also exhibited a preventive effect on PDGF-BB-induced migration (n=6). Western blot analysis showed that DIZE prevented the reduction in contractile protein levels induced by PDGF-BB (n=5), as did EVs isolated from cells treated with or without 1 μM DIZE (n=4). Conclusion: These findings suggest that DIZE did not increase the efficacy of EVs in preventing VSMC dedifferentiation, but the drug did have a direct effect on VSMC, suggesting a potential effect mediated through ACE2 activation, opening new avenues for its therapeutic use in cardiovascular diseases.