Identificación de genes asociados a resistencia a Cu y análisis de su sintenia en especies del género Pseudomonas aisladas desde muestras de suelos obtenidas del tranque de relaves Cauquenes

Abstract

El cobre (Cu) es un micronutriente esencial para la vida debido a su rol como cofactor en numerosas enzimas que catalizan procesos vitales, como la respiración celular y la defensa antioxidante. No obstante, en concentraciones elevadas, el Cu se convierte en un metal tóxico que puede causar estrés oxidativo a través de la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) y también puede estar asociado con el desplazamiento del Fe2+ por Cu+ en los centros hierro-azufre de ciertas proteínas, llevando a la pérdida de función enzimática. Dada esta dualidad, los organismos han desarrollado estrategias complejas para la homeostasis del Cu, ajustando meticulosamente su captación, uso, almacenamiento y eliminación para evitar la toxicidad mientras satisfacen sus necesidades nutricionales. Diversos mecanismos de resistencia al Cu han sido bien documentados, incluyendo sistemas de eflujo específicos, chaperonas que secuestran Cu, y enzimas que detoxifican el metal. Entre los sistemas de eflujo, el operón cop es uno de los más estudiados. En bacterias, tanto Gram-positivas, como Gram-negativas; este operón típicamente incluye una ATPasa de eflujo de Cu (CopA), una chaperona de Cu (CopZ) y un regulador transcripcional (CopY o CueR). Otro sistema relevante es el operón cus, exclusivo de bacterias Gram-negativas. Este sistema incluye el transportador CusCBA, que expulsa Cu desde el citoplasma al medio extracelular. La presencia y actividad de estos sistemas de eflujo se modulan según las concentraciones intracelulares de Cu, lo que permite a las células ajustar su respuesta a las fluctuaciones del ambiente metalífero. En este contexto, bacterias que habitan ambientes contaminados por Cu, como los tranques de relaves donde se acumulan altas concentraciones de metales pesados como resultado de la actividad minera, presentan una gran capacidad de resistencia al Cu. En ese sentido, el Tranque de Relaves Cauquenes en Chile, conocido por su alta concentración de Cu y condiciones extremas, representa un hábitat crítico para estudiar los mecanismos microbianos de resistencia al Cu. Este trabajo de memoria se centró en las bacterias del género Pseudomonas, reconocidas por su versatilidad metabólica y capacidad para adaptarse a condiciones ambientales desafiantes y que se encuentran altamente representadas en la comunidad bacteriana del tranque Cauquenes. Por ello se analizó la capacidad de crecer en medio suplementado con Cu y su capacidad de sobrevida frente al metal. Además se realizó una búsqueda de genes de resistencia a Cu y se analizó la sintenia entre las 10 especies de estudio. Los resultados revelaron una notable capacidad de resistencia a cobre que permitió clasificar las 10 especies en 3 grupos de resistencia según su CMI (baja, media y alta resistencia). Los resultados de la búsqueda de genes asociados a resistencia a Cu mostraron una gran conservación de los operones cop y cus, así como la presencia de otros genes asociados a resistencia como el operón pco o genes asociados al metabolismo del polifosfato (ppx y ppk), todos estos con diferentes números de copias dentro de los genomas. Finalmente, al estudiar la sintenia (orden de los genes) puede observarse que existe una relación entre esta y la capacidad de resistencia a Cu. La capacidad de Pseudomonas para resistir altas concentraciones de Cu no solo subraya su potencial para la adaptación a ambientes extremos, sino que también destaca su utilidad en aplicaciones biotecnológicas como la biorremediación de sitios contaminados con metales pesados.

Copper (Cu) is an essential micronutrient for life due to its role as a cofactor in numerous enzymes that drive vital processes such as cellular respiration and antioxidant defense. However, at elevated concentrations, Cu becomes a toxic metal that induces oxidative stress through the generation of reactive oxygen species (ROS) and displaces Fe²⁺ with Cu⁺ in iron-sulfur clusters of certain proteins, leading to the loss of enzymatic function. To manage this duality, organisms have evolved complex mechanisms for Cu homeostasis, finely regulating its uptake, utilization, storage, and removal to balance nutritional needs and toxicity prevention. Various Cu resistance mechanisms have been well-documented, including specific efflux systems, Cu-sequestering chaperones, and metal-detoxifying enzymes. Among efflux systems, the cop operon is one of the most studied, typically encoding a Cu efflux ATPase (CopA), a Cu chaperone (CopZ), and a transcriptional regulator (CopY or CueR) in both Gram-positive and Gram-negative bacteria. Another notable system is the cus operon, found in Gram-negative bacteria, which includes the CusCBA transporter that expels Cu from the cytoplasm to the extracellular environment. The activity of these efflux systems is modulated by intracellular Cu levels, enabling bacteria to adapt to fluctuating metal concentrations. Bacteria inhabiting Cu-contaminated environments, such as tailings dams that accumulate high concentrations of heavy metals from mining activities, exhibit remarkable Cu resistance. The Cauquenes Tailings Dam in Chile, characterized by high Cu concentrations and extreme environmental conditions, offers a critical habitat for studying microbial Cu resistance mechanisms. This study focused on bacteria of the Pseudomonas genus, known for their metabolic versatility and ability to thrive under challenging conditions, which are abundantly represented in the Cauquenes bacterial community. The research assessed the growth and survival of 10 Pseudomonas species in Cusupplemented media, identified genes associated with Cu resistance, and analyzed gene synteny within these species. The findings revealed notable Cu resistance, allowing classification of the species into three resistance groups (low, medium, and high) based on their minimum inhibitory concentrations (MICs). Gene analysis showed significant conservation of the cop and cus operons, alongside other resistance-related genes, such as the pco operon and genes linked to polyphosphate metabolism (ppx and ppk), with varying copy numbers across genomes. Additionally, synteny analysis revealed a correlation between gene order and Cu resistance capacity. The ability of Pseudomonas to tolerate high Cu concentrations highlights its potential for adaptation to extreme environments and underscores its biotechnological utility in applications such as the bioremediation of heavy metal-contaminated sites.