Evolución de la regulación alostérica por AMP en piruvato quinasas de arqueas metanogénicas del orden Methanococcales

Abstract

La piruvato quinasa (PK) cataliza la transformación de fosfoenolpiruvato (PEP) y complejo magnesio adensina difosfato (MgADP) en piruvato y adenosina trifosfato (ATP). En bacterias y eucariotas, la PK es regulada mediante efectores como la fructosa-1,6-bisfosfato y la adenosina monofosfato (AMP), mientras que en arqueas del filo Thermoproteota se ha descrito el 3-fosfoglicerato como efector alostérico. Aunque algunas PK de arqueas del filo Euryarchaeota, en particular del orden Methanococcales, como la PK de Methanocaldococcus jannaschii (MjPK) se activan por AMP, se reporta que la PK de Methanococcus maripaludis (MmPK) no responde a este efector en condiciones de PEP semi-saturante. No obstante, las predicciones estructurales muestran la conservación y adecuada disposición de los residuos para interacciones polares con AMP. En este trabajo se investigó la evolución de la activación por AMP y sus determinantes estructurales en PK de arqueas metanogénicas, caracterizando MmPK, MjPK y la PK del último ancestro común de Methanococcales (AncMcPK), reconstruida por inferencia ancestral. Las enzimas se expresaron en E. coli, se purificaron y se evaluaron sus parámetros cinéticos con PEP y ADP, determinándose la influencia de AMP. Los resultados revelaron que tanto MmPK como MjPK se activan por AMP, aunque en MjPK este efector solo modifica la afinidad cinética por PEP, mientras que en MmPK aumenta también la velocidad máxima. AncMcPK evidenció inhibición parcial por AMP, aunque la presencia de afinidad cinética y velocidades máximas marcadamente menores para ambos sustratos sugieren problemas en la reconstrucción de la secuencia ancestral. Ensayos de fluorescencia indicaron unión cooperativa de AMP a MmPK. Además, mediante cromatografía de exclusión molecular acoplada a dispersión de luz de ángulo múltiple en conjunto con mediciones de dicroísmo circular indicaron que MmPK es un tetrámero en solución. Para dilucidar la base estructural de la regulación por AMP en arqueas metanogénicas, se obtuvieron cristales de MmPK en ausencia de ligandos, en presencia de PEP y en cocristalización con PEP y AMP. Se determinó la estructura cristalina de MmPK en ausencia de ligandos y en presencia de PEP a 3 Å, constituyendo las primeras estructuras resueltas de una PK del filo Euryarchaeota. Adicionalmente, se logró determinar una estructura cristalina a 4.6 Å a partir de la co-cristalización de MmPK con PEP y AMP, pero no se encontraron los ligandos en la densidad electrónica. Los modelos obtenidos revelan que MmPK presenta un enlace disulfuro en el dominio tapa, que está ausente en MjPK, cuya reducción con agentes reductores potenció el efecto activador del AMP en ensayos de actividad a distintas concentraciones de AMP. Este trabajo destaca la importancia de la regulación alostérica por AMP en las PK de arqueas metanogénicas, sugiriendo que la activación por este efector es un rasgo conservado en el orden Methanococcales. Este estudio contribuye las primeras estructuras experimentales para un PK del filo Euryarchaeota y aporta a la compresión de la evolución de la regulación alostérica en estas enzimas.

Pyruvate kinase (PK) catalyzes the conversion of phosphoenolpyruvate (PEP) and MgADP into pyruvate and ATP. In both bacteria and eukaryotes, PK is regulated by effectors such as fructose-1,6-bisphosphate and AMP. In contrast, in archaea belonging to the phylum Thermoproteota, 3-phosphoglycerate has been identified as an allosteric effector. Some PKs from archaea in the phylum Euryarchaeota, particularly those from the order Methanococcales are activated by AMP like the PK of Methanocaldococcus jannaschii (MjPK). However, the PK from Methanococcus maripaludis (MmPK) belonging to the same order does not respond to AMP under half-saturating PEP conditions. Nonetheless, structural predictions indicate that the residues responsible for interactions with AMP are conserved and properly arranged in MmPK. In this work, the evolution of AMP activation and its structural determinants in methanogenic archaea PK was investigated by characterizing MmPK, MjPK, and the PK of the last common ancestor of Methanococcales (AncMcPK), reconstructed by ancestral inference. The enzymes were recombinantly expressed and purified in E. coli and their kinetic parameters with PEP and ADP were evaluated, determining the influence of AMP. The results revealed that both MmPK and MjPK are activated by AMP, although in MjPK this effector only modifies the kinetic affinity for PEP, while in MmPK it also increases the maximum velocity. AncMcPK exhibited partial inhibition by AMP, although the presence of kinetic affinity and maximum velocities for both substrates are very different compared to those of extant enzymes, which may be due to problems in the reconstruction of the ancestral sequence. Fluorescence assays indicated cooperative binding of AMP to MmPK. In addition, size exclusion chromatography coupled to multi-angle light scattering in conjunction with circular dichroism measurements indicated that MmPK is a tetramer in solution. To elucidate the structural basis of AMP regulation in methanogenic archaea, crystals of MmPK were obtained in the absence of ligands, in the presence of PEP, and in cocrystallization with PEP and AMP. The crystal structure of MmPK in the absence of ligands and in the presence of PEP was determined at 3 Å. A crystal structure at 4.6 Å was obtained from the co-crystallization of MmPK with PEP and AMP; however, the ligands were not detected in the electron density. The resulting models indicate that MmPK has a disulfide bond in the lid domain, which is not present in MjPK. Notably, reducing agents enhanced the activating effect of AMP in activity assays of MmPK conducted at various AMP concentrations. This work emphasizes the relevance of allosteric regulation by AMP in the PKs of methanogenic archaea suggesting that activation by this effector is a conserved characteristic within the Methanococcales order. This study provides the first experimental structures for a PK from the phylum Euryarchaeota and contributes to the understanding of the evolution of allosteric regulation in these enzymes.