Caracterización transcriptómica de células endoteliales cerebrales y evaluación de su integración vascular mediante el ensayo de la membrana corioalantoidea de embrión de Gallus gallus

Abstract

Las redes vasculares son esenciales para el correcto funcionamiento de los órganos y la mantención de la homeostasis celular, cumpliendo un papel importante en el transporte de nutrientes y desechos a través del organismo. Estas funciones dependen principalmente de las células endoteliales, las cuales forman el revestimiento interno de los vasos sanguíneos y muestran propiedades diferenciales según el órgano donde residen. Las células endoteliales cerebrales (BEC) conforman un microambiente vascular característico en conjunto con astrocitos, pericitos y neuronas. Esto les otorga propiedades específicas y les permite formar la barrera hematoencefálica (BHE), la cual regula el movimiento de moléculas y células entre la sangre y el cerebro. Dentro de las propiedades específicas de las BEC, se incluye la expresión de diversos transportadores y proteínas de uniones estrechas. Debido a las funciones claves que cumplen las BEC en la vasculatura cerebral, la alteración de estas células se ha asociado a enfermedades neurológicas. Bajo este escenario, ha surgido un interés creciente en estudiar las diversas facetas de la disfunción vascular en estas enfermedades. El uso de células troncales pluripotentes inducidas humanas (hiPSC) ha representado una estrategia prometedora para su estudio como una metodología in vitro para la obtención de BEC humanas. Sin embargo, recientemente se ha cuestionado la verdadera identidad endotelial de las BEC derivadas de hiPSC, sugiriendo más bien características epiteliales, tanto a nivel transcriptómico como funcional. Por ello, surge el interés de desarrollar metodologías para caracterizar el fenotipo endotelial a nivel transcriptómico y funcional. En el presente estudio se buscó comparar las características transcriptómicas de BEC y células endoteliales periféricas y, además, evaluar la factibilidad del ensayo de la membrana corioalantoidea (CAM) de embrión de Gallus gallus como un modelo in vivo de integración vascular de células endoteliales humanas. Para esto, se realizó una prueba de concepto con una línea celular inmortalizada de células endoteliales de microvasculatura cerebral humana (hCMEC/D3) y con cultivos primarios de células endoteliales de la vena de cordón umbilical humano (HUVEC), como modelo de endotelio periférico. Se evaluó la expresión de una serie de marcadores transcripcionales asociados a identidad endotelial mediante qPCR. Además, mediante el ensayo CAM, se evaluó la integración de estas células a los vasos sanguíneos. Se encontraron diferencias en los patrones de expresión génica de ambos tipos de células endoteliales. Concretamente, las células hCMEC/D3 expresan genes relacionados con las funciones específicas de las BEC de manera diferencial. Además, ambos tipos de células endoteliales parecieran ser capaces de migrar e integrarse a los vasos sanguíneos de la CAM. Estos hallazgos sugieren que las BEC expresan genes de identidad endotelial cerebral que permiten su caracterización a nivel transcriptómico, y que el modelo de la CAM representa una alternativa con gran potencial para la evaluación funcional in vivo de células endoteliales derivadas de hiPSC.

Vascular networks are essential for the proper functioning of organs and the maintenance of cellular homeostasis. They play a major role in the transport of nutrients and waste products throughout the body. These functions rely primarily on endothelial cells, which form the inner cellular lining of the blood vessels and display differential properties depending on the organ where they reside. Brain endothelial cells (BEC), along with astrocytes, pericytes, and neurons, form a characteristic vascular microenvironment. This induces specific blood-brain barrier (BBB) properties in BEC, which allow them to tightly regulate molecules and cell movement between blood and the brain. These properties include the expression of various transporters and tight junction proteins. Due to the key functions that BEC fulfill within the cerebral vasculature, the alteration of these cells has been associated with neurological diseases. In this scenario, there has been a growing interest in studying the various aspects of vascular dysfunction in these diseases. The use of human induced pluripotent stem cells (hiPSC) represents a promising strategy for their study as an in vitro method for obtaining human BEC. Nevertheless, the true endothelial identity of hiPSC-derived BEC has recently been questioned, suggesting rather epithelial characteristics at both transcriptomic and functional levels. Thus, there is an interest in developing methodologies to characterize the endothelial phenotype at transcriptomic and functional levels. In this study, we sought to compare the transcriptomic characteristics of BEC and peripheral endothelial cells and, in addition, to evaluate the feasibility of the chick embryo chorioallantoic membrane (CAM) assay as an in vivo model for vascular integration of human endothelial cells. Therefore, a proof of concept was carried out using an immortalized human cerebral microvascular endothelial cell line (hCMEC/D3) and primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC), as a model of peripheral endothelium. We evaluated the expression of a set of transcriptional markers related to endothelial identity by qPCR. Also, we assessed the integration of these cells into blood vessels using the CAM assay. We found differences in gene expression patterns for both types of endothelial cells. Particularly, hCMEC/D3 cells differentially express genes related to the specific functions of BEC. Furthermore, human endothelial cells appear to be capable of migrating and integrating into CAM blood vessels. These findings suggest that BEC express brain endothelial identity genes that enable their characterization at transcriptomic level, and that the CAM model is a high-potential alternative for in vivo functional evaluation of hiPSC-derived endothelial cells.