Optimización de las condiciones de fermentación sumergida para la producción de pigmentos rojos por hongos antárticos del género Pseudogymnoascus utilizando una metodología de superficie de respuesta

Abstract

Pseudogymnoascus verrucosus es una especie de hongo filamentoso prevalente de climas fríos con interesante potencial biotecnológico, pues produce pigmentos rojizos en medios sólidos de cultivo. Distintas industrias emplean pigmentos en sus sistemas productivos, existiendo actualmente especial interés por sustituir pigmentos sintéticos por pigmentos de origen natural. En consecuencia, P.verrucosus se presenta como una fuente interesante de pigmentos naturales. Respecto a la producción de productos naturales de origen microbiano en la industria, son las fermentaciones en biorreactores de cultivos sumergidos el sistema más comúnmente empleado. Considerando que hasta ahora no se había descrito condiciones de fermentaciones sumergidas en las que P.verrucosus produzca cantidades significativas de pigmento, en este trabajo se propuso encontrar dichas condiciones. Previamente, en trabajos del laboratorio, se había identificado en cepas de P.verrucosus, un cluster de genes de biosíntesis (azp), con homología con otros clusters fúngicos implicados en la producción de pigmentos tipo azafilona. Por lo que se propuso vincular la expresión de un gen de este cluster con la producción de pigmentos rojos en P.verrucosus. Para este trabajo, se dispuso de cuatro cepas de P.verrucosus aisladas de la Antártica: P.verrucosus FAE27, P.verrucosus FAE70, P.verrucosus FAE72 y P verrucosus FAE72. Durante este trabajo, se evaluó el efecto de las siguientes variables en la producción de pigmentos amarillos, naranjos y rojos en fermentaciones sumergidas de P.verrucosus: pH, temperatura, NaCl, agitación y diversas fuentes de carbono y nitrógeno. Estos experimentos evidenciaron que el medio PDB fue el más apto para inducir la producción de pigmentos rojos. Y se observó que al suplementar el medio PDB con extracto de papa y glucosa, aumentaba la pigmentación de los cultivos sumergidos. También, se observó que la velocidad de agitación de los cultivos regulaba la producción de pigmento en estos. Por consiguiente, se realizó un experimento de optimización de tipo Central Composite Design con las variables anteriores, evaluando agitación 50-250 RPM, concentración de papa 0g/L a 8g/L, y concentración de glucosa 0g/L a 20g/L. La metodología de superficie de respuesta que modela la producción de pigmento rojo en función de las variables de interés reveló que la pigmentación aumenta según aumenta la agitación del cultivo, la agitación optima obtenida para varias cepas fue 250 RPM. También aumentó la pigmentación al aumentar la concentración de extracto de papa, y se determinó para varias cepas que 8 g/L es la concentración óptima para maximizar pigmentación. Las concentraciones evaluadas de glucosa no mostraron efectos significativos en la pigmentación de los cultivos, incluso presentando inhibición de la producción de pigmentos en medios con alta concentración de glucosa. Para relacionar la producción de pigmento con la expresión de azp se ocuparon técnicas moleculares. Se analizó ADN genómico de las cepas de interés empleando PCR para verificar la presencia del gen azpA. Éste fue encontrado en las cuatro cepas de P.verrucosus, además se comprobó la ausencia de azpA en especies de Pseudogymnoascus que no producen pigmento rojo. Además, se realizó qRT-PCR en cultivos de FAE27 pigmentados y no pigmentados para correlacionar la producción de pigmentos rojos con la expresión de azpA. Se encontró una fuerte correlación entre la pigmentación y la expresión de azpA, respaldada por las absorbancias registradas.

Pseudogymnoascus verrucosus is a species of filamentous fungi commonly found in cold climates. This organism has great biotechnological potential because it produces red pigments in solid fermentation conditions. Several industries use pigments in their production systems, with a growing interest in replacing synthetic pigments with pigments of natural origin. In this context, P.verrucosus offers an interesting source of natural pigments. Submerged fermentation bioreactors are the most used method when it comes to the industrial production of natural products of microbial origin. Up until now, no culture conditions have been identified for maximization of red pigment production in P.verrucosus submerged fermentations, one aim of this study is to identify such conditions. In previous studies by our laboratory, a biosynthetic gene cluster (azp) had been identified in P.verrucosus as partially homologous with other fungal clusters implicated in azaphilone pigment production. Another objective of this study is to link the expression of one gene of the azp cluster with the production of red pigments in P.verrucosus. For the realization of this study, four strains of P.verrucosus isolated from the Antarctic were used: P.verrucosus FAE27, P.verrucosus FAE70, P.verrucosus FAE72, and P.verrucosus FAE72. Throughout this study, the effect of the following variables were assessed for the production of yellow, orange, and red pigments in shake flask cultures of P.verrucosus strains: pH, temperature, NaCl, agitation speed, and diverse sources of carbon and nitrogen. These experiments find PDB to be the best culture medium for the induction of red pigment production. They also determined that cultures in a PDB medium supplemented with potato extract and glucose have a higher pigment production than those not supplemented. In addition, the experiments indicate that the agitation speed of the shake flask cultures regulates pigment production. Therefore, an optimization experiment was conducted using a Central Composite Design with three variables, agitation speed, potato extract concentration, and glucose concentration, testing 50-250 RPM, 0g/L-8g/L and 0g/L 20g/L respectively. A response surface methodology that models the interaction between the interest variables and the red pigment production, revealed that pigmentation increases as the agitation speed increases. Resulting in an optimal agitation speed of 250 RPM for several strains of P.verrucosus. The production of red pigment also increased as the potato extract concentration increased, and it was determined for several of the strains evaluated that the optimal potato extract concentration is 8g/L for maximized red pigment production. The glucose concentrations evaluated did not show significant effects in the submerged fermentation culture pigment production, exhibiting inhibition of pigment production at high glucose concentrations. To associate red pigment production with the expression of azp molecular biology techniques were employed. Genomic DNA from the interest strains was analyzed using PCR to verify the presence of the azpA gene. This gene was found in all four interest strains of P.verrucosus. Additionally, the absence of the azpA gene was confirmed for Pseudogymnoascus species that do not produce red pigments. Finally, qRT-PCR was performed in P.verrucosus FAE27 cultures that produced pigment and cultures that did not, to link the red pigment production to azpA expression. A strong correlation was found between red pigmentation and azpA expression, supported by the absorbance registered.