Caracterización biofísica de la región C-terminal de la proteína DSUP de Ramazzottius varieornatus

Abstract

Las proteínas intrínsecamente desordenadas (IDPs) desafían el paradigma “una estructura-una función” debido a que son macromoléculas funcionales que carecen de la capacidad de plegarse espontáneamente en una estructura nativa. Dentro del grupo de los tardígrados, animales microscópicos que se caracterizan por su gran capacidad de sobrevivir ante una enorme variedad de condiciones de estrés abiótico, está la especie Ramazzottius varieornatus, la cual se destaca por su gran tolerancia a la exposición a la radiación ionizante; competencia que se ha asociado a la presencia de una proteína bautizada como Damage Supressor Protein (DSUP) debido a su estudio en diversos sistemas heterólogos de expresión. De acuerdo con análisis bioinformáticos y experimentales, DSUP correspondería a una IDP con un alto contenido de aminoácidos cargados positivamente y una alta flexibilidad para interactuar electrostáticamente con el ADN. Se ha demostrado que la formación de este complejo corresponde a un prerrequisito necesario para que DSUP pueda proteger el ADN y evitar quiebres de cadena. De acuerdo con su secuencia, se cree que la región C-terminal de DSUP (CDSUP) es la que ejerce la función de interactuar con el ADN y su mecanismo tanto de unión como de protección a la fecha siguen sin ser mayormente descritos. Con el objetivo de determinar si esta proteína se une inespecíficamente al ADN se realizaron estudios de cambio en la movilidad electroforética (EMSA) para diferentes secuencias de ADN. Estructuralmente, se determinó el contenido de estructura secundaria de CDSUP a diferentes concentraciones de trifluoroetanol (TFE) y en presencia de ADN mediante dicroísmo circular, determinando además el efecto del TFE en la afinidad con el ADN mediante anisotropía de fluorescencia. Además, se evaluó la capacidad de CDSUP de formar estados oligoméricos mediante cromatografía de exclusión molecular (SEC) y ensayos de entrecruzamiento con formaldehído Los resultados indican que CDSUP corresponde a una IDP capaz de unir ADN inespecíficamente, y que, al formar un complejo con el ADN, esta proteína adquiere una estructura helicoidal que favorece su interacción con el ligando. Además, corresponde a una proteína que aparentemente forma dímeros a concentraciones altas, pero que dicho estado está fuertemente desfavorecido. Finalmente, en este trabajo se demostraron algunos aspectos estructurales que permite dar una idea de cómo esta proteína es capaz de unirse al ADN en el contexto celular y como su naturaleza desestructurada puede ser la clave para el resto de los procesos celulares en los que participa.

Intrinsically disordered proteins (IDPs) are proteins that challenge the "one structure-one function" paradigm due their natural functionality even when they do not spontaneously fold into a native structure. Among the tardigrades -microscopic animals that are characterized by their great ability to survive in the face of an enormous variety of abiotic stress conditions- the species Ramazzottius varieornatus is well-known by its high tolerance to ionizing radiation, where this ability has been associated with the presence of a protein called Damage Supressor Protein (DSUP). According to bioinformatic and experimental analysis, DSUP would correspond to an IDP that takes advantage of its richness of positively charged amino acids and its high flexibility to interact electrostatically with DNA. It has been shown that the formation of this complex corresponds to a prerequisite for DSUP to be able to protect DNA from breaks. According to its sequence, it is believed that the C-terminal region of DSUP (CDSUP) exerts the function of interacting with DNA and its mechanism of both binding and protection to date remains largely uncharacterized. In order to determine whether this protein binds non-specifically to DNA, electrophoretic mobility change (EMSA) studies were performed for different DNA sequences. Structurally, the secondary structure content of CDSUP was determined at different concentrations of trifluoroethanol (TFE) and in the presence of DNA by circular dichroism, whereas the effect of TFE on DNA affinity was determined by fluorescence anisotropy and the ability of CDSUP. Finally, size exclusion chromatography (SEC) and formaldehyde crosslinking assays were employed to characterize the ability of CDSUP to form high-order molecular species. The results indicate that CDSUP corresponds to an IDP that binds DNA non-specifically, by forming a complex with DNA. In this complex, the protein acquires a helical structure that favors its interaction with the ligand. In addition, it corresponds to a protein that apparently forms dimers at high concentrations, but that state is strongly unfavored. Finally, in this work, structural and functional properties allowed us to give an idea of how this protein can bind to DNA in the cellular context and how its unstructured nature may be the key to the rest of the cellular processes in which it participates.