Nanopartículas plasmónicas para la detección y la reducción de la toxicidad in vivo de especies oligoméricas solubles de β-amiloide

Abstract

La acumulación de agregados del péptido β-amiloide (Aβ) constituye uno de los principales biomarcadores utilizados tanto en el diagnóstico como en el seguimiento de la enfermedad de Alzheimer (EA). No obstante, su detección suele ser posible únicamente cuando ya se ha producido un daño significativo en el sistema nervioso central, lo que se traduce en un deterioro cognitivo evidente. Actualmente, el diagnóstico definitivo de la EA solo puede confirmarse mediante un examen post mortem. En este contexto, durante las últimas décadas, los esfuerzos de investigación se han centrado en el desarrollo de técnicas que permitan un diagnóstico temprano de la EA, con el objetivo de posibilitar intervenciones terapéuticas oportunas que puedan modificar el curso de la enfermedad. Diversas sondas fluorescentes como aquellas pertenecientes a la familia CRANAD tales como CRANAD-2, son interesantes para el desarrollo de potenciales aplicaciones para el diagnóstico de la EA basados en la detección de A. Esta sonda se une de forma selectiva a agregados de Aβ, presentando fluorescencia en la región infrarroja del espectro, lo cual lo hace especialmente interesante para imagenología. No obstante, esta sonda presenta un bajo rendimiento cuántico lo que puede reducir la sensibilidad de detección de los agregados de β-amiloide. Por otra parte, las nanopartículas de oro debido a sus propiedades de Resonancia del Plasmón Superficial pueden producir un aumento de la fluorescencia. Este último efecto es conocido como Fluorescencia Amplificada por Superficie. Es así como las nanopartículas pueden ser modificadas en su superficie, añadiendo elementos de diagnóstico como la sonda CRANAD y/o de direccionamiento y terapia como los péptidos de la serie D, los cuales se unen selectivamente a Aβ y tienen la potencialidad de desagregar e inhibir la agregación de Aβ. En esta tesis, se obtuvieron nanopartículas plasmónicas de tipo Core-Shell funcionalizadas con el péptido D3 y con un derivado de CRANAD-2, que permite el reconocimiento selectivo de especies solubles de Aβ, para aumentar la señal emitida por la sonda. Así como también, se realizaron evaluaciones del efecto del péptido D3 (rprtrlhthrnr) dispuesto sobre las nanopartículas sobre la estructura de especies solubles de Aβ tanto in vitro como in vivo. Para determinar la capacidad del nanosistema de atravesar barreras biológicas y ser internalizado por células, se analizaron los mecanismos de ingreso en la línea celular SH-SY5Y, empleando inhibidores específicos de distintas vías de internalización. Los resultados mostraron que el péptido D3 favorece la internalización de las nanobarras de oro a través de la endocitosis mediada por caveolas. Finalmente, los efectos del nanosistema se evaluaron in vivo utilizando modelos de Caenorhabditis elegans que expresan el péptido Aβ(1-42) humano en células musculares. Los resultados obtenidos indican que el nanosistema desarrollado no solo mejoró significativamente la detección de Aβ, sino que también disminuyó los efectos tóxicos de sus agregados, lo que se reflejó en una mejora en la capacidad neuromotora de los organismos tratados. Los hallazgos de esta investigación muestran que la funcionalización de nanopartículas plasmónicas con el péptido D3 y un derivado de CRANAD-2 permite una detección más eficiente de las especies tóxicas oligoméricas solubles de Aβ y contribuye a reducir su toxicidad en modelos animales. Estos resultados sugieren un potencial terapéutico y de diagnóstico para el desarrollo de nuevas estrategias en el estudio de enfermedades neurodegenerativas asociadas a Aβ.

The accumulation of amyloid-β (Aβ) peptide aggregates is one of the main biomarkers used in both the diagnosis and monitoring of Alzheimer's disease (AD). However, its detection is usually only possible when significant damage to the central nervous system has already occurred, resulting in evident cognitive impairment. Currently, the definitive diagnosis of AD can only be confirmed by postmortem examination. In this context, in recent decades, research efforts have focused on the development of techniques that allow for early diagnosis of AD, with the aim of enabling timely therapeutic interventions that can modify the course of the disease. Various fluorescent probes, such as those belonging to the CRANAD family, such as CRANAD-2, are interesting for the development of potential applications for AD diagnosis based on the detection of Aβ. This probe binds specifically to Aβ aggregates, exhibiting fluorescence in the infrared region of the spectrum, making it especially interesting for imaging. However, this probe has a low quantum yield, which can reduce the detection sensitivity of β-amyloid aggregates. Furthermore, gold nanoparticles, due to their Surface Plasmon Resonance properties, can produce an increase in fluorescence. This latter effect is known as Surface Enhanced Fluorescence. Thus, nanoparticles can be surface-modified, adding diagnostic elements such as CRANAD and/or targeting and therapeutic elements such as D-series peptides, which selectively bind to Aβ and have the potential to disaggregate and inhibit Aβ aggregation. In this thesis, core-shell plasmonic nanoparticles functionalized with the D3 peptide and a CRANAD-2 derivative were obtained, which allows the selective recognition of soluble Aβ species, thus increasing the signal emitted by the probe. Likewise, evaluations were conducted of the effect of peptide D3 (rprtrlhthrnr) on the nanoparticles on the structure of soluble Aβ species both in vitro and in vivo. To determine the nanosystem's ability to cross biological barriers and be internalized by cells, the entry mechanisms in the SH-SY5Y cell line were analyzed, using specific inhibitors of different internalization pathways. The results showed that peptide D3 promotes the internalization of gold nanorods through caveolae-mediated endocytosis. Finally, the effects of the nanosystem were evaluated in vivo using Caenorhabditis elegans models that express the human Aβ(1-42) peptide in muscle cells. The results indicate that the developed nanosystem not only significantly improved Aβ detection but also decreased the toxic effects of its aggregates, which was reflected in an improvement in the neuromotor capacity of the treated organisms. The findings of this research shows that functionalizing plasmonic nanoparticles with the D3 peptide and a CRANAD-2 derivative allows for more efficient detection of soluble toxic Aβ species and contributes to reducing their toxicity in animal models. These results suggest therapeutic and diagnostic potential for the development of new strategies in the study of Aβ-associated neurodegenerative diseases.