Rol de integrina α11 en la reparación de heridas en la mucosa masticatoria

Abstract

La mucosa masticatoria comprende un tejido conectivo y epitelial que protege los dientes a nivel del cuello dentario y la mucosa palatina. A este nivel el tejido conectivo establece una firme unión con el hueso y diente, lo que previene la penetración de bacteriana y entrega resistencia a las fuerzas de masticación. El colágeno tipo I es la principal molécula estructural que permite esta unión entre mucosa, tejido dentario y hueso y su regeneración es crítica para la mantención de la función protectora de la mucosa masticatoria. La formación de fibras colágenas es un fenómeno guiado por fibroblastos que, a través de receptores conocidos como integrinas, promueven la interacción de estas células con fibras de colágeno, facilitando fenómenos como la adhesión y migración celular, así como la síntesis y formación de fibras colágenas funcionales. Estos receptores corresponden a las integrinas de unión a colágeno y durante la reparación de heridas de piel, la integrina α11 ha mostrado un papel importante permitiendo la diferenciación de miofibroblastos involucrados en la síntesis de colágeno de la dermis en reparación. Es importante destacar que los tejidos conectivos de la piel y encía tienen importantes diferencias estructurales y funcionales, y el papel de la integrina α11 en la regeneración de heridas de la encía no ha sido dilucidado. En base a estos antecedentes se propone la siguiente hipótesis: “La deficiencia en el gen de integrina α11 en ratones se asocia a una reducción en la reparación del tejido conectivo de la mucosa masticatoria y una menor capacidad de fibroblastos de ratón para contraer el colágeno.” En este proyecto se evaluó el papel de la integrina α11 en la reparación de heridas de la mucosa masticatoria utilizando un modelo murino knock-out (KO) para la integrina α11 (ITGA11), para lo cual se introdujeron secuencias LoxP que flanquearon este gen. A su vez, la recombinasa Cre se expresó bajo el control del promotor Col1α2 (Col3.6), restringiendo la deleción a células fibroblásticas, incluidos los miofibroblastos. Este modelo permitió estudiar la función de ITGA11 en procesos de reparación tisular. Se utilizaron además fibroblastos gingivales que fueron inmortalizados a partir de tejido gingival de ratones knock-out (KO) y silvestres (WT) para integrina α11. Los resultados de estas tesis mostraron que fibroblastos gingivales deficientes en integrina α11 presentan una reducción significativa en la contracción de geles de colágeno, tanto flotantes como adheridos. Mediante RT-qPCR se evaluó la expresión de genes que cumplen un papel importante en la interacción entre fibroblastos y regulación de la matriz extracelular. Los resultados de esta evaluación mostraron que en ausencia de integrina α11 se detectó una reducción significativa en la expresión de periostina. Sin embargo, en estos experimentos la ausencia de la expresión de ITGA11 no afectó los niveles transcripcionales de los genes Integrina α2, Advilina, Colágeno XII, Colágeno 1α2, Glypican-3, Metaloproteínasa-13, Catepsina-K, Receptor tipo de interleukina1, y Actina de músculo liso de tipo alfa. Por medio de Western blot del lisado total de fibroblastos gingivales se confirmó una disminución significativa en los niveles proteicos de periostina en fibroblastos gingivales de ratones deficientes en integrina α11. Para evaluar in vivo el papel de integrina en la reparación de la mucosa masticatoria, se realizaron heridas en la mucosa que recubre el paladar en ratones WT y KO para integrina α11. El análisis histológico de estas heridas evaluadas a los 4 y 7 días de evolución no mostró diferencias en el área ocupada por el coágulo de fibrina, cierre y espesor del epitelio, ni volumen del tejido de granulación entre la condición KO y WT. Sin embargo, utilizando la tinción de Rojo Sirio asociada a microscopía de luz polarizada, se observó una reducción significativa en la formación de fibras colágenas a los 4 y 7 días de reparación en las heridas de ratones KO versus la condición WT. Los resultados de este proyecto indican que integrina α11 juega un papel importante en la neoformación de colágeno durante la reparación de heridas de la mucosa masticatoria a través de la regeneración de fibras de colágeno y regulación de la expresión de periostina, proteína clave en la mantención de la funcionalidad del tejido conectivo periodontal y formación de fibras colágenas. Es interesante destacar que la ausencia de expresión de integrina α11 no afectó los niveles de colágeno 1α2, ni de actina de músculo liso de tipo alfa, lo que permite proponer que los efectos favorables de integrina α11 sobre la regeneración de fibras de colágeno serían mediados por la capacidad de este receptor para compactar las fibras de colágeno a través de su contracción y por medio de la expresión de periostina, proteína que participa en la adhesión entre colágeno y fibroblastos. Estos resultados permiten proponer un nuevo papel, hasta el momento desconocido, de la participación de integrina α11 en la reparación de heridas de la mucosa masticatoria. Estos nuevos hallazgos podrían ser importantes para la identificación de mecanismos en la reparación de lesiones de la mucosa masticatoria de relevancia clínica.

The masticatory mucosa consists of connective and epithelial tissue that protects the teeth at the cervical level and the palatal mucosa, establishing a firm attachment to this structure and preventing the penetration of bacteria into deeper tissues. Type I collagen is the primary structural molecule that enables this attachment between the gingiva and dental tissue, and its regeneration is critical for maintaining the protective function of the gingiva. The formation of collagen fibers is a process guided by fibroblasts, which, through receptors known as integrins, promote the interaction of these cells with collagen fibers, facilitating phenomena such as cell adhesion and migration, as well as the synthesis and formation of functional collagen fibers. These receptors correspond to collagen-binding integrins, and during skin wound healing, integrin α11 has shown an important role by enabling the differentiation of myofibroblasts involved in the synthesis of collagen in the repairing dermis. It is important to note that the connective tissues of the skin and gingiva have significant structural and functional differences, and the role of integrin α11 in gingival wound regeneration has not yet been elucidated. Based on this background, the following hypothesis is proposed: “Deficiency of the integrin α11 gene in mice is associated with reduced repair of the connective tissue of the masticatory mucosa and a lower capacity of mouse fibroblasts to contract collagen.” In this project, the role of integrin α11 in wound healing of the masticatory mucosa was evaluated using a murine knockout (KO) model for integrin α11 (ITGA11), in which loxP sequences flanked this gene. Additionally, Cre recombinase was expressed under the control of the Col1α2 (Col3.6) promoter, restricting deletion to fibroblastic cells, including myofibroblasts. This model allowed the study of ITGA11 function in tissue repair processes. Gingival fibroblasts were also used, which were immortalized from gingival tissue of integrin α11 knockout (KO) and wild-type (WT) mice. The results of this thesis showed that gingival fibroblasts deficient in integrin α11 exhibit a significant reduction in the contraction of both floating and attached collagen gels. RT-qPCR was used to evaluate the expression of genes that play an important role in fibroblast interaction and extracellular matrix regulation. The results of this evaluation showed that in the absence of integrin α11, a significant reduction in the expression of periostin was detected. However, in these experiments, the absence of ITGA11 expression did not affect the transcript levels of the genes Integrin α2, Advillin, Collagen XII, Collagen 1α2, Glypican-3, Metalloproteinase-13, Cathepsin-K, Interleukin-1 type receptor, and alpha-smooth muscle actin. Western blot analysis of total lysates from gingival fibroblasts confirmed a significant decrease in periostin protein levels in gingival fibroblasts from integrin α11-deficient mice. To evaluate in vivo the role of integrin in masticatory mucosa repair, wounds were made in the mucosa covering the palate in WT and KO mice for integrin α11. Histological analysis of these wounds at 4 and 7 days post-injury showed no differences in the area occupied by the fibrin clot, epithelial closure and thickness, or granulation tissue volume between KO and WT conditions. However, using Sirius Red staining associated with polarized light microscopy, a significant reduction in collagen fiber formation was observed at 4 and 7 days of repair in wounds from KO mice compared to WT. The results of this project indicate that integrin α11 plays an important role in collagen neoformation during wound healing of the masticatory mucosa through the regeneration of collagen fibers and regulation of periostin expression, a key protein in maintaining the functionality of periodontal connective tissue and collagen fiber formation. Interestingly, the absence of integrin α11 expression did not affect the levels of collagen 1α2 or alpha-smooth muscle actin, suggesting that the beneficial effects of integrin α11 on collagen fiber regeneration may be mediated by this receptor’s ability to compact collagen fibers through contraction and by the expression of periostin, a protein involved in collagen-fibroblast adhesion. These results propose a previously unknown role for integrin α11 in masticatory mucosa wound healing. These new findings may be important for identifying mechanisms in the repair of clinically relevant masticatory mucosa injuries.